Os macrófagos são células plasmáticas do sistema hematopoiético que desempenham um papel crucial na imunidade protetora e na homeostase. Neste relatório , descrevemos técnicas otimizadas in vitro para caracterizar fenotípica e funcionalmente macrófagos reguladores infiltrantes de enxerto que se acumulam no órgão transplantado em condições tolerogênicas.
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Artigo de método
Caracterização funcional de macrófagos regulatórios que inibem a imunidade reativa ao enxerto
Neste artigo
Resumo
Resumo
A acumulação de macrófagos em órgãos transplantados tem sido reconhecida como uma característica da rejeição de aloenxerto 1 . Os monócitos imunogênicos infiltram o aloenxerto logo após o transplante, montam uma resposta reativa do enxerto contra o órgão transplantado e iniciam a rejeição dos órgãos 2 . Dados recentes sugerem que os macrófagos supressivos facilitam o transplante de longo prazo com êxito 3 e são necessários para a indução de tolerância ao transplante 4 . Isso sugere um conceito multidimensional de ontogenia, ativação e função de macrófagos, que exige um novo roteiro para isolamento e análise da função de macrófagos 5 . Devido à plasticidade dos macrófagos, é necessário fornecer uma metodologia para isolar e caracterizar macrófagos, dependendo do ambiente de tecido, e definir suas funções de acordo com diferentes cenários. Aqui, nós descrevemosSeja um protocolo para a caracterização imune de macrófagos infiltrados por enxerto e os métodos que usamos para avaliar funcionalmente sua capacidade de inibir a proliferação de CD8 + T e promover a expansão de Treg de CD4 + Foxp3 + in vitro .
Introdução
Este protocolo descreve técnicas in vitro para estudar a função de macrófagos infiltrantes de tecidos isolados de aloenxertos cardíacos, de acordo com sua capacidade de modular as respostas de células T. Amplamente descritos na literatura, corantes de rastreamento de células fluorescentes em combinação com citometria de fluxo, são ferramentas poderosas para estudar a função supressiva de tipos celulares específicos in vitro e in vivo. Nosso protocolo segue o método do éster de succinimidil de carboxifluoresceína (CFSE) para monitorar a proliferação de linfócitos in vitro .
Quando uma célula marcada com ....
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Protocolo
Neste estudo, os camundongos são alojados de acordo com as diretrizes do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos e as recomendações do Guia do Serviço de Saúde Pública para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todas as técnicas experimentais envolvendo uso animal foram realizadas de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Utilização e Cuidados de Animais Institucionais (IACUC) da Faculdade de Medicina Mount Sinai.
1. Preparação de mídia
- Prepare o meio RPMI 1640 completo com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (10 000 U / mL) usando L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não e....
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Resultados
Os resultados representativos mostram a estratégia de bloqueio descrita no protocolo acima. Os resultados também exibem a análise da atividade de proliferação de células T após a co-cultura com macrófagos infiltrados por enxerto. A capacidade supressiva in vitro de subconjuntos de macrófagos foi analisada na Figura 4 . Os resultados indicam que o Ly6C lo Ly6G - macrófagos obtidos de receptores tolerados são supressivos. Os resultados também.......
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Discussão
Este protocolo descreve os métodos que usamos para imuno-caracterizar subconjuntos de células mieloides infiltradas por enxerto em um modelo experimental murino de transplante cardíaco, que também é aplicável a outros tecidos em diferentes modelos experimentais murinos. A classificação de células de baixa pressão a 20 psi foi o método preferido para isolar um bom rendimento de subconjuntos de células puras. Manter a pureza de cada subconjunto mielóide é fundamental para estabelecer resultados conclusivos da capacidade d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Reconhecemos as contribuições técnicas dos Centros de Citometria de Fluxo, Microcirurgia e Biopositório / Patologia de Excelência em Pesquisa no Monte Sinai. Este trabalho foi apoiado pela Ação COST BM1305: Ação para Focar e Acelerar Terapêuticas Tolerogênicas Celulares (A FACTT), os fundos de desenvolvimento do Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute, Ministério da Ciência e Inovação SAF2013-48834-R e SAF2016-80031-R JO
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1.000x 2-mercaptoetanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamina | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Não Aminoácidos essenciais | Corning | 25025039 | |
| 1 M tampão HEPES | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific SH30239.01 | ||
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (sem cálcio& magnésio) | Corning | 21031CV | |
| 70 µ m Filtro de células | Fisher | 22363548 | |
| ACK tampão de lise | Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Ativador de células T de camundongo CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 poços Placa inferior em U | Corning | 353077 | |
| Anticorpos: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe / Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp / Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC / Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Citômetro de Fluxo | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | O Laboratório Jackson | 008374 | |
| C57BL / 6 | O Laboratório Jackson | 000664 | |
| Balb / c | O Laboratório Jackson | 000651 |
Referências
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocyte....
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Reimpressões e permissões
