Hormonforstyrrende forbindelser (EDC) utgjør en betydelig risiko for vannmiljøet. Kommunale renseanlegg er store bidragsytere til østrogen potens av overflatevann. Metodikken gitt i denne artikkelen gir en vurdering av effekt og egnethet av renseprosesser med hensyn til EDC fjerning.
Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in a watch list of environmental pollutants under the European Water Framework Directive. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. Much of the estrogenic potency of wastewater treatment plant (WWTP) effluents can be attributed to the discharge of steroid estrogens including estradiol (E2), EE2 and E1 due to incomplete removal of these substances at the treatment plant. An evaluation of the efficacy of wastewater treatment processes requires the quantitative determination of individual substances most often undertaken using chemical analysis methods. Most frequently used methods include Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS/MS) or Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM). Although very useful for regulatory purposes, targeted chemical analysis can only provide data on the compounds (and specific metabolites) monitored. Ecotoxicology methods additionally ensure that any by-products produced or unknown estrogenic compounds present are also assessed via measurement of their biological activity. A number of in vitro bioassays including the Yeast Estrogen Screen (YES) are available to measure the estrogenic activity of wastewater samples. Chemical analysis in conjunction with in vivo and in vitro bioassays provides a useful toolbox for assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to estrogenic endocrine disrupting compounds. This paper utilizes a battery of chemical and ecotoxicology tests to assess conventional, advanced and emerging wastewater treatment processes in laboratory and field studies.
Bekymringer om de negative virkningene av hormonforstyrrende forbindelser på dyreliv reproduktiv helse har ført til at EU til å plassere to østrogen stoffer (østradiol og etinyløstradiol) på en "watch list" under vannrammedirektiv (WFD). EDC omfatter en rekke kjemiske klasser, inkludert naturlig og syntetisk steroid østrogen, narkotika, plantevernmidler og industrielle kjemikalier og bestanddeler av forbrukerprodukter med kjente skadevirkninger på dyreliv. Noen av disse forbindelsene potensielt kan påvirke menneskers helse 1.
Forskning har vist at utslipp fra renseanlegg er østrogen å fiske 2 og som en konsekvens mange resipienten er også østrogen for fisk tre. Dette ble første gang påvist gjennom nasjonale undersøkelser i Storbritannia som viste økt vitellogenin konsentrasjoner (en kvinnelig bestemt eggeplomme protein forløper 4) i blodet hos vill mannlige fisk og en høy prevalens intersex (utvikle egg og / eller kvinnelige kjønns kanaler i testiklene av hannfisk) i normalt gonochoristic fiskearter 5,6.
Konvensjonell kloakk behandling er vanligvis en tre trinns prosess som består av en innledende screening etterfulgt av primær og sekundær behandling som fjerner både oppløst og suspendert organisk materiale. Effekten av fjernelse av individuelle EDC er avhengig av de fysisk-kjemiske egenskaper av stoffene og på effektiviteten av behandlingsprosessen anvendt. For mange EDC fjerning via adsorpsjon og biologisk nedbrytning kan være betydelig, men ufullstendig. Tertiær behandling, for eksempel sand filtrering, kan være effektiv ved å øke EDC fjernelse 7, mens avansert behandling ved hjelp av avansert oksidering (for eksempel ozon) eller aktivert karbon kan være effektive for å oppnå nær fullstendig fjerning 7.
Vurderingen av ny teknologi for rensing av avløpsvann needs for å bestemme effekten av den foreslåtte fremgangsmåten i EDC fjerning. Et batteri av tester, inkludert målrettet kjemisk analyse sammen økotoksikologi testing, ved å bruke in vivo og in vitro bioanalyser, gir omfattende data for dette formålet. Selv om svært nyttig for regulatoriske formål, kan målrettede kjemiske analysen bare gi opplysninger om forbindelser (og spesifikke metabolitter) overvåket. Bioassays i tillegg la den "deteksjon" av negative effekter av metabolitter og behandling genererte avløpsvann transformasjon biprodukter som ellers ville være ubemerket 8,9. Dette notatet beskriver bruken av et batteri av kjemisk og vannmiljø laboratorieanalyser for å vurdere effekten av en rekke avanserte og nye renseprosesser i å fjerne østrogen potens av råolje og renset kloakk og motta farvann.
Renseanlegg er den viktigste ruten for overvann forurensning med EDC. En evaluering av effektiviteten av fjerning av endokrin aktivitet av konvensjonelle, avanserte eller nye behandlingsprosesser krever bruk av en rekke kjemiske og biologiske analyser. Kjemisk analyse ved hjelp av ikke-målrettede og målrettet analyse gir kvalitative eller kvantitative data om effekten av fjerning av enkeltkomponenter og derfor gjør en vurdering som skal gjøres mot miljøkvalitetsstandarder eller spådd ingen effektkonsentrasjoner for forbindelser eller blandinger av forbindelser analysert.
Genereringen av omdanningsprodukter som følge av ufullstendig mineralisering av stoffer etter behandling og nærværet av ukjente biologisk aktive komponenter i spillvannet begrenser nytten av kjemiske tester alene. En kombinasjon av in vivo og in vitro bioassay i kombinasjon med analytisk kjemiry screening gir en nyttig verktøykasse for å fastslå effekten av EDC fjerning av nye renseprosesser. Disse testene, når utført sammen med tradisjonelle vannkvalitetsparametre og andre toksikologiske og mikrobiologiske endepunkter tillate en kritisk vurdering av nåværende og kommende renseteknologier.
Det er viktig å merke seg at gjær basert østrogen skjermer (f.eks, YES) er ikke den eneste in vitro assays for å bestemme østrogene potens av kjemikalier og avløpsvann. En rekke av stabilt transfekterte pattedyrcellebaserte analyser er blitt utviklet for, for eksempel, henholdsvis ER-CALUX 27 og hERα-HeLa-9903 28 med humane brystcancerceller eller cervikale tumorceller. Den JA har blitt sammenlignet med tilsvarende pattedyrcellebaserte analyser og har blitt funnet å ha et tilsvarende høyt nivå av reproduserbarhet, sanne positive og sanne negative østrogen identifikasjons priser 29, selv omugh det er noen ganger vurdert å være litt mindre følsom 27. En fordel med gjær basert reporter analyser er at i laboratorier uten betydelig erfaring med pattedyrcellekultur JA kan lettere vedtatt, da det krever mindre strenge tiltak bio-kontroll og sterile teknikker (YES kan utføres på benken toppen om nødvendig) . De menneskecelle baserte analyser krever også CO 2 inkubatorer og luminometers sammenlignet med standard inkubator og mikro lesere som brukes i JA. To gjær basert østrogen reporter analyser (JA, Saccharomyces cerevisiae og A-JA, Arxula adeninivorans) er for tiden gjennomgår interlaboratorie løyper for validering av ISO 19040 "Vannundersøkelse – Bestemmelse av østrogen potensialet for vann og avløp" fremhever de næringer interessen for disse teknikkene.
Det finnes en rekke begrensninger i de metoder som er beskrevet som omfatter den potensielle forurensningav prøvene under prøvetaking, prøveoppbevaring og analyse med østrogen stoffer som kommer fra felt eller laboratorium miljøet eller menneskelig forurensning (f.eks myknere, tensider, personlig pleie produkter). Denne type av forurensning i YES-analysen (eller andre cellebaserte analyser rapportør) vil heve bakgrunnen og påvirke bruken av analysen. Vannprøver eller løsemidler som er lagret i plastflasker kan lett føre til falske positiver. Falske negative er også av interesse både LCMS / MS og JA analysen krever SPE å konsentrere østrogener til påvisbare nivåer. Matrisen, valg av SPE sorbent og elueringsløsningsmiddel kan påvirke ekstraksjonseffektiviteten og de typer av forbindelser eluert. Ved hjelp av C18 SPE-patron for ekstraksjon ved anvendelse av betingelsene beskrevet i denne protokollen kan danne en negativ forspenning, som sterkt polare og basiske forbindelser ville bli dårlig beholdes av sorbenten. Videre krever denne protokollen tilberedning av elueres JA elueringsmiddel fra metanol til etanol via fordampning til tørrhet funder nitrogen som resulterer i tap av flyktige forbindelser. Som et resultat av protokollen kunne gi underestimert østrogenisk aktivitet av testede prøver. Disse begrensningene er spesielt viktig når de vurderer JA analysen som ukjente eller uventede forbindelser kan være savnet, fordi de ikke har blitt trukket ut, eller de går tapt på grunn av fordampning. Videre gjør LCMS / MS teknikk bruken av merkede interne standarder for å korrigere for utvinning; denne fremgangsmåten kan ikke brukes med YES-analysen.
Betydelige begrensninger av in vivo-testing av avløpsvann omfatter høye kostnadene og tiden som kreves for vurdering sammenlignet med in vitro metoder. For tiden bruken av fiskeembryo tester for å påvise østrogen aktivitet er begrenset. Imidlertid har det vært en viss suksess med å produsere østrogen responsive transgen glødende fiskeembryoer 30, som kan ha fremtidige søknader. Fathead ørekyt (brukt i denne protocol) er en vanlig laboratorie art og vtg induksjon i hannfisk er et godt dokumentert bio-markør på østrogeneksponering og en målbar grad av avløpsvannet østrogenisitet 22 eller andre østrogen-forbindelser eller blandinger 31. OECD test retningslinjer for hormonforstyrrende kjemikalier er godkjent for bruk voksen Hodet ørekyte, japansk medaka og sebrafisk 32,33, med VTG være en sensitiv biomarkør av østrogen eksponering i alle tre arter. Men VTG induksjon ikke direkte relateres til forplantningsskader og derfor de økologiske konsekvensene av avløpsvann eksponering, sett i alvorlig intersex mort tre. På den annen side, mort er ikke en klassisk 'laboratorium artens for økotoksikologi forskning på grunn av sin store størrelse, lang generasjonstid (2-3 år å nå seksuell modenhet), reproduktiv stil; gruppe gyting (avl) finner sted en gang i året, og det er vanskelig å identifisere menn fra kvinner (andre enn undergytesesongen). Imidlertid har dette normalt gonochoristic arter blitt svært godt studert i Storbritannia, på grunn av oppdagelsen av at nedstrøms av østrogen avløpsvann utslipp, mannlige fisk utstilt forstyrrelsene til sin endokrinologi (f.eks tilstedeværelse av kvinnelige spesifikke vitellogenin i blodet) og histopatologi (ovotestes – utvikle egg i testiklene og / eller kvinnelige kjønns kanaler) 5,6. Derfor, som en fremtidig anvendelse av disse protokollene, mort (eller lignende arter) kan være et nyttig vill Sentinel arter å vise om reelle forbedringer i avløpsvann kvalitet (og redusert østrogenisiteten) er sett i elver som får avansert behandlet avløpsvann. De kan også være ansatt i slutten av rørsystemer til å overvåke teknologisk forbedret utslipp fra pilotskala planter 7. Når du vurderer hvilke arter som skal brukes i in vivo avløpsvann vurderingene er det en avveining mellom relativt rask og kontrollert testing med laboratorie arter i forhold tillengre feltbasert, men mer miljø relevant, testing ved hjelp av stedegne arter. Men slik in vivo vurderingene er høye kostnader og bør bare betraktes som det siste settet med tester følgende vurderinger ved hjelp av kjemisk analyse og in vitro-analyser.
Kritiske trinnene i protokollen beskrevet omfatter fremstillingen og håndteringen av prøver og glass (dvs. flasker og prøvetakingsutstyret skal forbehandles med passende overflateaktivt rengjøringsmiddel) for å unngå forurensning av prøver fra miljøforurensninger inkludert begrensende prøvene kommer i kontakt med plast og andre materialer som kan produsere falske positiver. Dette er like viktig når designe og bygge akvarier og fisk eksponeringssystemer. Ideelt akvarier (bolig aksjer og under eksponeringer) bør bygget av materialer med lav adsorpsjon 32 med minimal forurensning risiko. Rustfritt stål kan brukes til avløp eller vannholdetanker.Mens tanker av en glasskonstruksjon er foretrukket for fisketanker (da dette gir også enkel observasjon av fisken). Bruken av lav karakter plastrør eller slangen bør unngås 32, kan PVC 34 og ABS brukes hvis 'riktig krydret ", dvs igjen å lekke ut eventuelle forurensninger i rennende fortynning vann i minst 12 timer før bruk. Medisinsk silisium slangen har vært ansatt hell i våre anlegg for slangepumpe levering av kjemikalier og avløpsvann / fortynning vann til tanker. Samt vurderer østrogen forurensning i bygging og drift av aquatics system, er det også viktig å tenke på kosthold på fisk; mange anstendighet fiskefor har vist seg å være østrogene til fisk. Derfor er det viktig å teste noen matvarer for aktivitet (for eksempel i gjær Østrogen Screen, Se Beresford et al. 14) før du bruker dem i disse typer studier.
Feilsøkingav kjemisk analyse eller JA analyseprotokoller beskrevet forenkles hvis kvalitetssikringsprøver inkludert flere reiser, laboratorium og løsemiddel blanks analyseres sammen med positive kontroller og reelle prøver å eliminere falske positive og falske negative resultater. Positiv (f.eks EE2) og negative (fortynning bare vann) kontroll bør også alltid brukes i in vivo-tester for å bekrefte følsomheten forventet biologisk biomarkør eller endepunkt (dvs. VTG eller histopatologi), og la noen uventet forurensning skal oppdages ( for eksempel fra eksperimentelle oppsett, kosthold, eller fortynning farvann). Eventuelle endringer i protokollen skal valideres før gjennomføre enhver undersøkelse.
Med strengere regulering av østrogen forbindelser inn i miljøet via renseanlegg utslipp er det for seg at mer effektive renseteknologier må utvikles. Batteriet av testene som er beskrevet i dette manuskriptet komplimentøkotoksikologiske og kjemiske evalueringstester normalt til grunn for renseanlegg utslipp av lukt. Derfor, for å fremtidig bruk av denne type helhetlig batteri av testen bør sette avløpsvann teknologiutviklere og driftsoperatører, iverksette de mest økologisk trygg design vurderer de beste metodene for å fjerne både spesifikke regulert østrogen kjemikalier og generell biologisk aktivitet.
The authors have nothing to disclose.
Projects presented in this paper were funded by Severn Trent Water and Brunel University London. The authors would like to thank Alan Henshaw and John Churchley for providing field and laboratory assistance. T.J.C. thanks the Heinz Endowments for support. M.R.M. thanks the Steinbrenner Institute for a Steinbrenner Doctoral Fellowship and Carnegie Mellon University for a Presidential Fellowship.
Wellwash Versa plate washer | Thermo Scientific | 5165010 | |
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax 340PC | |
Incubator | Memmert | INB 400 | 37oC incubation required for carp assay |
Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
Icemaker | Scotsman | AF80 | |
12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
ELISA kits | Biosense Laboratories | V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp) |
|
Microfuge tubes, 0.5ml | Alpha labs | LW2372 | |
Microfuge tubes, 1.5ml | Alpha labs | LW2375 | |
Sulphuric acid, 95-98% | Sigma-Aldrich | 258105 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Histology | |||
Tissue processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
Wax dispenser | Thermo Scientific Raymond Lamb | E66HC | |
Metal embedding mold | Leica Biosystems | Various | |
Hot plate | Thermo Scientific Shandon | 3120063 | |
Cold plate (EG1150 C) | Leica Biosystems | 14038838037 | |
Heated forceps (EG F) | Leica Biosystems | 14038835824 | |
Microtome | Leica Biosystems | RM2235 | |
Paraffin section floatation bath | Electrothermal | MH8517 | |
Slide drying bench | Electrothermal | MH6616 | |
Stainmate automated stainer | Thermo Scientific Shandon | E103/S10L | |
Cassettes, Histosette II, biopsy | Simport | M493 | |
Paraffin wax | Thermo Scientific Raymond Lamb | W1 | |
Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | |
IMS (ethanol mix), IDA99 | Tennants | ID440 | |
Polysine adhesion slides | Thermo Scientific Gerhard Menzel | J2800AMNZ | |
Cover slips, 22x50mm | VWR | 631-0137 | |
Histomount | National Diagnostics | HS-103 | |
Haematoxylin Harris GURR | VWR | 351945S | |
Eosin, 1%, aqueous | Pyramid Inovation | S20007-E | |
Fisherbrand slide boxes | Fisher Scientific | 11701486 | |
Microtome blades, MB35 | Thermo Scientific Shandon | 3050835 | |
Bouin’s solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Yeast screen | |||
Flow cabinet | Labcaire Systems Ltd | SC12R | |
Cooled incubator | LMS Cooled Incubator | 303 | |
Incubator | Memmert | INB 400 | |
Shaker | Grant | PSU-10i | |
Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
Plate shaker | Heidolph Titramax 100 | 544-11200-00 | |
12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
12-channel pipette, electronic | Sartorius | 735441 | |
96-well flat-bottom microplates | MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt |
76-232-05 260860 82.1581.001 |
We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds |
HPLC grade water | Rathburn | RH1020 | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
Potassium phosphate monobasic anhydrous | Sigma-Aldrich | P-5655 | |
Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A-2939 | |
Potassium hydroxide, pellets | Sigma-Aldrich | P-1767 | |
Magnesium sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Iron (III) sulfate | Sigma-Aldrich | 307718 | |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L-8912 | |
L-Histidine | Sigma-Aldrich | H-6034 | |
Adenine | Sigma-Aldrich | A-2786 | |
L-Argenine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | A-6969 | |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M-5308 | |
L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T-8566 | |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I-7403 | |
L-Lysine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | L-8662 | |
L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P-5482 | |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G-8415 | |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V-0513 | |
L-Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | |
Thiamine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | T-1270 | |
Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P-5669 | |
D-Pantothenic acid, hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P-5155 | |
Inositol | Sigma-Aldrich | I-5125 | |
d-Biotin | Sigma-Aldrich | B-4639 | |
D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers | Sigma-Aldrich | G-7021 | |
L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A-4534 | |
L-Threonine | Sigma-Aldrich | T-8441 | |
Copper (II) sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Chlorophenolred-b-D galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 10884308001 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G-2025 | |
17 β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E-8875 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Steroids | |||
Acetone | Rathburn | ||
Acetonitrile | Rathburn | ||
Ammonia solution | Rathburn | ||
Ethylacetate | Rathburn | ||
Copper(II) nitrate. | Sigma-Aldrich | ||
Acetone | Rathburn | ||
Dichloromethane | Rathburn | ||
2, 4, 16, 16-d4-17b-estradiol | CDN Isotopes | ||
2, 4, 16, 16-d4-estrone | CDN Isotopes | ||
2, 4, 16, 16-d4-17a-ethynyl oestradiol. | CDN Isotopes | ||
17b-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
Estrone | Sigma-Aldrich | ||
17a-ethynyl oestradiol. | Sigma-Aldrich | ||
Hexane | Rathburn | ||
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | ||
Methanol | Sigma-Aldrich | ||
Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | ||
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | ||
Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) | Biotage | ||
Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) | Biotage | ||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Fish study | |||
orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 | watson marlow | 982.0063.000 | |
straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 | watson marlow | 999.2008.000 | |
pumsil silicon tubing 0.8 bore 15m | watson marlow | 913.A008.016 | |
200 series multi-channel persitaltic pump | watson marlow | 205CA | |
Silicone tubing x15m (dosing tanks) | vwr | SFM1-3250 | |
silicone tubing x 15m (large for inflow/outflow) | vwr | SFM1-5450 | |
2.5L glass winchester pk 4 | Fisher Scienctific | BTF-505-050B | |
magnetic stir bar 51x8mm pk 10 | Fisher Scienctific | FB55595 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) | sigma aldrich | E10521-10G | |
17α-Ethynylestradiol | sigma aldrich | E4876-100MG | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SPE | |||
1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk4 | sigma aldrich | 57276 | |
disposable liners for manifold | sigma aldrich | 57059 | |
filtration tubes without frits 6ml pk 30 | sigma aldrich | 57242 | |
reservior adaptors pk 12 | sigma aldrich | 57020-U | |
stainless steel weight for manifold pk 4 | sigma aldrich | 57278 | |
male luer plug for manifold pk12 | sigma aldrich | 504351 | |
SPE Vacuum Manifold | sigma aldrich | 57265 | |
stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 | waters | WAT054806 | |
Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50 | waters | WAT020515 | |
Methanol HPLC grade 2.5L | fisher scientific | M/4056/17 | |
7ml glass vials with lids (58x17mm) pk 399 | fisher scientific | TUL-520-031K | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
vacuum pump e.g. VP Series Vacuum Pump | Camlab | 1136915 |