שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות
Summary
מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).
Abstract
הוכחה גוברת מציין שאת hematopoiesis נורמלי מוסדר על ידי רמזים microenvironmental נפרדות ב ויטביע, הכוללים נישות הסלולר מיוחדים להתכוונן קריטי לתאי גזע hematopoietic (HSC) פונקציות1,2. אכן, תמונה מפורטת יותר של microenvironment hematopoietic זה עכשיו מתעוררים, בו את endosteal, גומחות אנדותל ליצור יחידות פונקציונליות לוויסות האנרגיות HSC רגיל ו שלהם רומא3,4,5 . מחקרים חדשים גילו את החשיבות של תאים perivascular, adipocytes, תאים עצביים תוך שמירה על וויסות HSC פונקציה6,7,8. יתר על כן, יש עדויות לכך תאים שושלות שונות, כלומר התאים מיאלואידית, הלימפה, הבית, שוכנים בתוך נישות ספציפיות בתוך microenvironment מוניטור. עם זאת, מיפוי מלאה של microenvironment את מוניטור ואת דייריו נמצאת בעיצומה.
העכבר הטרנסגניים זנים שושלת היוחסין סמני פלורסנט ספציפי או עכברים מהונדסים חוסר שנבחר מולקולות תאים מסוימים של הגומחה מוניטור זמינים כעת. הנוק-אאוט, שושלת היוחסין מעקב מודלים, בשילוב עם גישות השתלת, מספקים הזדמנות לחדד את הידע על תפקיד ספציפי “נישה” תאים עבור אוכלוסיות hematopoietic מוגדרים, כגון מועדון הכדורגל מונפלייה, תאי-B, T-תאים, התאים מיאלואידית ו תאים erythroid. אסטרטגיה זו יכול להיות potentiated עוד יותר על-ידי מיזוג השימוש של מיקרוסקופ שני הפוטונים של החילונית. על ידי מתן ויוו הדמיה ברזולוציה גבוהה עיבוד תלת-ממדי של החילונית מוניטור, אנו יכולים עכשיו לקבוע במדויק את המיקום שבו הנדונים hematopoietic בבית ויטביע ולהעריך את קינטיקה של התרחבותן לאורך זמן. כאן, ליס-GFP העכברים הטרנסגניים (סימון התאים מיאלואידית)9 ו RBPJ עכברים הנוק-אאוט (שחסר איתות חריץ קנונית)10 משמשים בשילוב עם IVFM כדי לקבוע את engraftment של התאים מיאלואידית microenvironment מוניטור פגומה חריץ.
Introduction
מיקרוסקופ זריחה multiphoton intravital (IVFM) היא טכניקת הדמיה עוצמה המאפשרת ברזולוציה גבוהה, בזמן אמת הדמיה של רקמות עם עומק עד 1 מ מ, בהתאם הרקמה. כאשר חל החילונית העכבר, הוא מאפשר לצפות בהתנהגות של התאים hematopoietic בתוך ויטביע בצורה לא פולשנית עד ל- 60-100 μm11. גישה זו משמשת כאן כדי לקבוע את קינטיקה של engraftment של אבות מיאלואידית נורמלי בעכברים מעלף מוניטור של RBPJ חסר איתות חריץ הקנוני.
העבודה האחרונה של הקבוצה שלנו הפגינו הזה פגום הקנוני חריץ איתות ב ללידים microenvironment מוניטור המחלה כמו myeloproliferative12. אובדן של חריץ איתות הושג על-ידי מחיקת מותנה המחשבים איגוד ה-DNA של RBPJ, גורם שעתוק קריטי במורד הזרם של חריץ הקנוני איתות, באמצעות Mx1-Cre המושרה רקומבינציה10. במחקר זה, שימש המודל עכבריםלקס/סלומון Mx1-Cre/RBPJ. מותנה מחיקה של מוטיב מחייב DNA RBPJ גורמת לאובדן של איתות של כל חריץ קולטנים. במודל Mx1-Cre, Cre הביטוי הוא מונע על ידי האמרגן Mx1 מופעל על מינהל polyI:C וכתוצאה מכך תנאי הגיוס של מחיקה ג’ין יישוב בתאי הדם, כמו גם כמו רכיבים סטרומה באיברים רבים, כולל מוניטור, הטחול והכבד.
Mx1-Cre+/RBPJסלומון/סלומון ועכבריםלקס/סלומון Mx1-Cre–/RBPJ המושרה עם polyI:C (לכאן בזמן שנסעתי מסומן כמו RBPJKO ו- RBPJWT, בהתאמה) היו אולם מוקרן, מושתלים עם נורמלי, פראי סוג תאים hematopoietic. החל מן השבוע 4 לאחר ההשתלה, הנמענים RBPJKO פיתח הסטה משמעותית ואחריו טחול מוגדל. למרות RBPJKO עכברים המוצגים אחוז מוגברת של אבות מיאלואידית ויטביע בשבוע 8 לאחר ההשתלה, בנקודות זמן מאוחר יותר, ניתוח של מוניטור שבועות 4 ו- 6 לא חשפו הבדלים מרשים בתוכן התאים מיאלואידית שלהם לעומת שליטה RBPJWT הנמענים. התבוננות זו, יחד עם העובדה כי Mx1-Cre מתבטא באיברים שונים hematopoietic, העלה את השאלה אם microenvironment מוניטור הייתה השפעה ישירה על אתחול של פנוטיפ myeloproliferative.
כדי לקבוע אם ויטביע היה אתר הראשוני הקריטי להתפתחות המחלה, שימשה IVFM של החילונית העכבר בשילוב עם השתלת (BMT), המודל הנוק-אאוט RBPJ ו שושלת מערכת מעקב מוניטור. העכברים הטרנסגניים לבטא EGFP תחת השליטה של יזם (Lys-GFP) ליזוזים ספציפי9 שימשו כדי להשיג תאי התורם יכול, ניתן לאבחן בזמן מוניטור הדמיה לאחר BMT. ליזוזים הביטוי הוא ספציפי התאים מיאלואידית וסימון Lys-GFP לתאים מ המייצר מיאלואידית נפוצות (CMP) בוגרת גרנולוציט13.
IVFM של ויטביע בנקודות זמן שונות הראו כי תאים Lys-GFP שני חיבורים באופן דומה לנמענים מוניטור של RBPJWT ו- RBPJKO, אבל מורחבת, engrafted מהר יותר ב הנמענים מוניטור של RBPJKO. הבדל זה היה דרמטי בנקודת זמן קודמת (לשבוע שבין 2) וירידה לאורך זמן (שבועות 4 ו- 6). עם זאת, בנקודות זמן מאוחר יותר אלה, של תא hematopoietic לאותו הנמען הראה על עלייה מתמדת במספר התאים מיאלואידית במחזור PB והערכת מותאם הטחול של עכברים RBPJKO, המציין את פלט מוגברת של תאים מ ויטביע למחזור. ניתוח של ליס-GFP תאים לוקליזציה ב ויטביע של המושתלים עכברים בגיל 6 שבועות גילה כי התאים מיאלואידית היו המתגוררים רחוק יותר להערכת microenvironment RBPJKO מאשר בפקד.
באופן קולקטיבי, השילוב של IVFM עם מודלים בבעלי חיים ספציפיים אלה מספק תובנות על הדינמיקה engraftment של התאים מיאלואידית microenvironment RBPJKO מוניטור. עיצוב ניסיוני ואת בשיטה כמותית המתוארים כאן מוצע כמו פרדיגמה שניתן להחיל כדי לטפל שאלות דומות. לדוגמה, השימוש של השושלת ספציפיים אחרים תא מעקב מודלים, כגון RAG1-GFP14 או15 Gata1-GFP עכברים, עשוי לאפשר בעקבות התנהלות הלימפה או אבות erythroid, בהתאמה, בתוך ויטביע.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר בעל עיצוב ניסיוני אופטימיזציה ללמוד את קינטיקה של תאים hematopoietic engraftment על ידי מיקרוסקופ נמכרות Intravital. במחקר זה, הרחבת ובתאים מיאלואידית ונדירה של מוניטור WT או בכל חריץ איתות מוניטור פגום היה מסומנים בהחילונית עצם על ידי הבאים Lys-GFP התאים מיאלואידית חיובי לאחר BMT אל נמענים RBPJW…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הדמיה התבצע במרכז אינדיאנה על מיקרוסקופ ביולוגי באוניברסיטת אינדיאנה, בבימויו של ד ר קן דאן. המכשיר stereotaxic הוא אב טיפוס ועוצב על ידי מארק Soonpaa, וולס המרכז לחקר רפואת ילדים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), המחקר MPN קרן (NC), שיתוף פעולה CTSI פרויקט IUSM/נוטרה דאם (NC).
Materials
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2X2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28g, 1/2cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
References
- Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
- Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
- Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
- Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
- Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
- Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
- Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
- Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).
