Intravital fluorescens mikroskopi (IVFM) av calvarium brukes i kombinasjon med genetisk dyremodeller å studere drap og engraftment av blodkreft cellene i benmargen (BM) nisjer.
Økende bevis viser at vanlige hematopoiesis er regulert av forskjellige microenvironmental bunker i BM, inkluderer spesialisert mobilnettet nisjer modulerende kritiske blodkreft stem cell (HSC) funksjoner1,2. Faktisk fremstår et mer detaljert bilde av blodkreft microenvironment nå, der den endosteal og den endothelial nisjer form funksjonelle enheter for regulering av normal HSC og deres avkom3,4,5 . Nye studier har vist betydningen av perivascular cellene, adipocytter og neuronal vedlikeholde og regulere HSC funksjon6,7,8. Videre er det bevis for at celler fra ulike linjene, dvs lymfoide og myeloide celler, hjem og bor i spesifikke nisjer i BM-microenvironment. En fullstendig kartlegging av BM-microenvironment og beboerne er imidlertid fortsatt pågår.
Transgene musen stammer uttrykke lineage bestemt fluorescerende markører eller mus genmodifiserte for å mangler utvalgte molekyler i bestemte celler i BM nisje er nå tilgjengelig. Knock-out og avstamning sporing modeller, sammen med transplantasjon tilnærminger, gi salgsmuligheten for å fornye kunnskap om rollen av “nisje” celler for definerte blodkreft bestander, som HSC B-celler, T-celler, myeloide celler og erythroid celler. Denne strategien kan være ytterligere potentiated ved å flette bruk av to-fotonet mikroskopi av calvarium. Ved å gi i vivo høy oppløsning bilder og 3D-gjengivelse av BM-calvarium, kan vi nå bestemme nøyaktig plassering der bestemte blodkreft delsett hjemme i BM og evaluere the kinetics av deres ekspansjon over tid. Her, brukes Lys-GFP transgene mus (markering myeloide celler)9 og RBPJ bank-out mus (mangler kanoniske hakk signalisering)10 i kombinasjon med IVFM til å bestemme engraftment av myeloide celler til et hakk defekt BM microenvironment.
Intravital multiphoton fluorescens mikroskopi (IVFM) er en kraftig tenkelig teknikk som gir det høy oppløsning, sanntid imaging av vev med dybde opp til 1mm, avhengig av vev. Når brukt på mus-calvarium, tillater det observere atferden til blodkreft cellene i BM på en ikke-invasiv måte opp til 60-100 μm11. Denne fremgangsmåten brukes her til å bestemme the kinetics av engraftment av normal myelogen progenitors i BM av RBPJ bank-out mus mangler kanoniske hakk signalering.
Siste arbeid fra vår gruppe vist at defekt kanoniske hakk signalering i BM microenvironment fører til en myeloproliferative-lignende sykdom12. Tap hakk signalnettverk ble anskaffet av betinget sletting av DNA bindende domenet RBPJ, kritisk transkripsjon faktoren nedstrøms for kanoniske hakk signalnettverk, bruker Mx1-grobunn indusert rekombinasjon10. I denne studien ble Mx1-grobunn/RBPJlox/lox mus modell brukt. Betinget sletting av DNA-bindende motivet av RBPJ resulterer i tap av signal fra alle hakk reseptorer. I Mx1-grobunn modellen, grobunn uttrykk er drevet av Mx1 selskapet aktiveres ved administrasjon av polyI:C som resulterer i induksjon av målrettet genet sletting i blod celler så vel som stromal komponenter av flere organer, inkludert BM, milt og lever.
Mx1-grobunn+/RBPJlox/lox og Mx1-grobunn–/RBPJlox/lox mus indusert med polyI:C (heretter angitt som RBPJKO og RBPJWT, henholdsvis) var drepende bestrålt og transplantert normalt, vill type blodkreft cellene. Fra uke 4 etter transplantasjon, utviklet RBPJKO mottakere betydelige leukocytose etterfulgt av splenomegali. Selv om RBPJKO mus presentert økt andel av myelogen progenitors i BM på uke 8 etter transplantasjon og senere tidspunkt, avsløre analyse av BM uker 4 og 6 ikke slående forskjeller i deres myelogen celleinnholdet i forhold til kontrollen RBPJWT mottakere. Denne observasjon, sammen med det faktum at Mx1-grobunn uttrykkes i ulike blodkreft organer, reist spørsmålet om BM microenvironment hadde direkte innvirkning på initiering av myeloproliferative fenotypen.
For å fastslå om BM var en kritisk første side av sykdom utvikling, ble IVFM av mus-calvarium brukt i kombinasjon med BM transplantasjon (BMT), RBPJ bank-out modellen og en slektslinje sporingssystem. Transgene mus uttrykke EGFP under kontroll av bestemte lysozyme promoter (Lys-GFP)9 ble brukt til å få giver celler som kan visualiseres under BM imaging etter BMT. Lysozyme uttrykk gjelder myeloide celler og Lys-GFP markerer celler fra vanlige myelogen stamfar (CMP) til eldre granulocytt13.
IVFM med BM på ulike tidspunkt vist at Lys-GFP celler homed tilsvarende til BM av RBPJWT og RBPJKO mottakere, men utvidet og engrafted raskere i BM av RBPJKO mottakere. Denne forskjellen var dramatisk på det tidligere tidspunktet (uke 2) og gått ned over tid (uker 4 og 6). Men på disse senere tidspunkt, evaluering av blodkreft kupé i samme mottaker viste en jevn økning i antall myeloide celler i PB og lokalisert i milten av RBPJKO mus, som indikerer en økt produksjon av celler fra BM i sirkulasjonen. Analyse av Lys-GFP celler lokalisering i BM transplantert mus for 6 ukens avdekket at myeloide celler ble bosatt videre fra er blodkar i RBPJKO microenvironment enn i kontrollen.
Kollektivt, gitt kombinasjonen av IVFM med disse bestemte dyremodeller innsikt i engraftment dynamics av myeloide celler i RBPJKO BM-microenvironment. Eksperimentell design og kvantitativ tilnærming er beskrevet her er foreslått som et paradigme som kan brukes for å løse lignende spørsmål. For eksempel bruk av andre celle bestemt avstamning sporing modeller, for eksempel RAG1-GFP14 eller Gata1-GFP15 mus, kan følgende virkemåte lymfoide eller erythroid progenitors, i BM.
Denne protokollen beskriver en eksperimentell design optimalisert for å studere the kinetics av blodkreft cellene engraftment av Intravital fluorescerende mikroskopi. I denne studien ble utvidelse av myeloid progenitor celler i en WT BM eller et hakk signalering defekt BM sporet i bein calvarium av følgende Lys-GFP positive myeloide celler etter BMT i RBPJWT eller RBPJKO mottakere. Denne tilnærmingen er foreslått som en modell som kan brukes på adressen lignende spørsmål, for eksempel: jeg) å finne ekspansjon og …
The authors have nothing to disclose.
Bildebehandling ble gjennomført i Indiana Center for biologisk mikroskopi ved Indiana University, ledet av Dr. Ken Dunn. Stereotaxic enheten er en prototype designet og utviklet av Mark Soonpaa, Wells senter for Pediatric forskning. Dette arbeidet ble støttet av NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN forskning Foundation (NC) og CTSI samarbeid prosjektet IUSM/Notre Dame (NC).
Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2X2 |
Nair depilatory cream | Commercial store | ||
Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28g, 1/2cc |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
Optical microscope oil | Leica | ||
Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |