Los monocitos son componentes integrales del sistema inmune innato humano que dependen del metabolismo glucolítico cuando se activan. Describimos un protocolo de citometría de flujo para medir la expresión del transportador de glucosa y la absorción de glucosa por monocitos totales y subpoblaciones de monocitos en sangre total fresca.
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Artículo de método
Una citometría de flujo simple método para medir la captación de glucosa y la expresión del transportador de la glucosa por monocitos subpoblaciones en sangre entera
En este artículo
Resumen
Resumen
Los monocitos son células inmunes innatas que se pueden activar por patógenos y la inflamación asociados con ciertas enfermedades inflamatorias crónicas. La activación de monocitos induce funciones efectoras y un cambio concomitante de oxidativo con el metabolismo glicolítico que se acompaña de aumento de la expresión del transportador de glucosa. Este aumento del metabolismo glicolítico se observa también para la inmunidad entrenado de los monocitos, una forma de memoria inmunológica innata. Aunque se han descrito los protocolos in vitro que examinan la expresión del transportador de glucosa y la captación de glucosa por los monocitos, ninguno ha sido examinado por el flujo multi-paramétrico citometría en la sangre entera. Se describe un protocolo de citometría de flujo multiparamétrica para la medición de la absorción de glucosa análogo 2-NBDG fluorescente en sangre entera por los monocitos totales y la clásica (CD14 ++ CD16 -), intermedio (CD14 ++ CD16 +) y no clásica ( CD14 + CD16 ++) monocitossubpoblaciones. Este método se puede utilizar para examinar la expresión del transportador de glucosa y la captación de glucosa para los monocitos totales y subpoblaciones de monocitos durante la homeostasis y la enfermedad inflamatoria, y se puede modificar fácilmente para examinar la captación de glucosa para otros leucocitos y subpoblaciones de leucocitos en la sangre.
Introducción
Los monocitos son un componente importante del sistema inmunitario innato humano que se movilizó rápidamente a los sitios de infección e inflamación 1. La activación de los monocitos es crítico para limitar los daños por patógenos aguda y también es central en la patogénesis de varias enfermedades crónicas, incluyendo la aterosclerosis 2, cáncer de 3, y el VIH 4,5.
El metabolismo de reposo y monocitos activados difiere drásticamente, con monocitos en reposo que utilizan el metabolismo oxidativo y monocitos activados que utilizan el metabolismo glucolítico (es decir, la fermentación de l....
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Protocolo
NOTA: infectados por el VIH y los sujetos no infectados por VIH fueron reclutados de la Unidad de Enfermedades Infecciosas en el Hospital Alfred en Melbourne, VIC, Australia, y de la comunidad local, respectivamente. El consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes, y la investigación fue aprobado por el Comité de Investigación y Ética del Hospital Alfred.
1. Glut1 Detección de la superficie celular en monocitos y monocitos subpoblaciones
- Recoger la sangre en tubos anticoagulantes de citrato ACD-B y comenzar los experimentos en una cabina de seguridad biológica dentro de 1 hora de recogida.
- Añadir 100 ....
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Resultados
La compensación debe ser realizada por fluorocromos individuales para prevenir las fluorescencias. Los monocitos son primero enriquecidas mediante la selección sobre la base de dispersión frontal y lateral. Las parcelas presentados son representantes de al menos seis experimentos independientes llevados a cabo en toda la sangre de seis o más participantes como se informó anteriormente 10 La figura 1A muestra la gating inicial de los monocitos por dispersión ce.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí detalla un método simple para examinar la expresión del transportador de glucosa y la absorción de glucosa análogo fluorescente por monocitos y monocitos subpoblaciones en la sangre entera. Mediante la evaluación de la captación de 2-NBDG en sangre entera, esta técnica permite condiciones similares a las in vivo. Un estudio anterior examinó 6-NBDG captación en monocitos resultantes de la separación por centrifugación de densidad 17. Sin embargo, este estudio no examinó las .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por el Centro Australiano para el VIH y la hepatitis Virología Investigación (ACH 2) y una subvención del desarrollo 2010 (CNIHR) de la Universidad de Washington Center for AIDS Research (CFAR), un programa financiado por el NIH con el número premio AI027757 que se apoya por el siguiente NIH Institutos y Centros (NIAID, NCI, NIMH, el NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP es un receptor de la subvención 2 CNIHR y ACH. SMC es un receptor de un Salud y medicina Consejo Nacional de Investigación de Australia (NHMRC) Principal beca de investigación. Los autores agradecen la contribución a este trabajo del Programa de Apoyo a....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| VACUETT Tubo 9 ml Tubos anticoagulantes ACD-B | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| polipropileno | BD Biosciences | 352063 | |
| Albúmina de suero bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Solución de formaldehído al 16% | Microscopía electrónica Science | 15710 | |
| BD FACS solución de lisado (10x) | BD Biosciences | 349202 | Solución de lisis BD FACS diluida 1/10 con agua desionizada para la concentración de trabajo (almacenar hasta 1 semana a 4 & °; C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspenda 5 mg de 2-NBDG en 1 ml de agua desionizada para hacer una solución madre de 14,60 mM (mantener hasta 6 meses a 4 & deg; C). Para hacer la concentración de trabajo 2-NBDG, diluya el material 1/100 con 1x DPBS. Cubra con papel de aluminio. (almacene hasta por 1 semana a 4 & grados; C) |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (1x) | Life technologies | 14190-144 | Para hacer la solución de lavado, agregue 0,5 g de BSA por 100 ml de DPBS (almacene hasta por 2 semanas a 4 & deg; C) |
Referencias
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., ....
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Reimpresiones y permisos
