גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה
Summary
אנו מדגימים מערכת היווצרות bilayer שומנים שאפשר לשמור, יבילה. קרום bilayer השומנים יכול להיווצר בתוך שעה 1 עם למעלה מ -80% אחוזי הצלחה כאשר מבשר קרום קפוא מובא טמפרטורת הסביבה. מערכת זו תפחית תהליכי מייגע ומומחיות הקשורים תעלות יונים.
Abstract
Bilayer שומנים מלאכותי, או קרום שומנים שחור (BLM), הוא כלי רב עצמה ללימוד תעלות יוני אינטראקציות חלבון, כמו גם עבור יישומי biosensor. עם זאת, טכניקות היווצרות BLM קונבנציונליות יש כמה חסרונות ולעתים קרובות הם דורשים מומחיות ספציפית ותהליכים מייגעים. בפרט, BLMs הקונבנציונלי סובל משיעורי הצלחת היווצרות נמוכים וזמן היווצרות קרום עקבי. הנה, אנחנו מדגימים מערכת היווצרות BLM שאפשר לשמור יביל עם זמן דליל יוצא שיהיה בשליטת וקצב היווצרות BLM משופרת על ידי החלפת סרטים כמקובל בשימוש (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, קלקר) כדי polydimethylsiloxane (PDMS). בניסוי זה, פולימר נקבובי מובנה כגון סרט דק PDMS משמש. בנוסף, בניגוד ממסים כמקובל בשימוש עם צמיגות נמוכה, השימוש הסקוואלין מותר זמן דליל-אאוט נשלט באמצעות קליטת ממס איטית ידי PDMS, הארכת חי קרום. במודעהdition, באמצעות תערובת של סקוואלין hexadecane, נקודת הקיפאון של הפתרון השומנים הוגדל (~ 16 ° C), בנוסף, מבשרי קרום הופקו שניתן לאחסן ללא הגבלת זמן והובל בקלות. מבשרי קרום אלה צמצמו זמן היווצרות BLM של <1 hr והשיגו קצב היווצרות BLM של ~ 80%. יתר על כן, ניסויי ערוץ יון באות A gramicidin הדגימו את ההיתכנות של מערכת הממברנה.
Introduction
קרום bilayer שומנים מלאכותי, או קרום שומנים שחור (BLM), הוא כלי חשוב עבור הבהרת מנגנונים של קרום תא תעלות יונים, כמו גם להבנת אינטראקציות בין תעלות יונים ויונים / מולקולות. 1-7 למרות ששיטת תיקון- clamp לעתים קרובות נחשב את תקן הזהב עבור מחקרים קרום התא, זה מייגע ודורש מפעילים מיומנים מאוד למדידות ערוץ יון. 8 בעוד ממברנות bilayer השומנים מחדש באופן מלאכותי התפתחו כמו כלים חלופיים ללימודי ערוץ יון, 9,10 הם קשורים גם עם מייגע תהליכי התמחות ספציפית. יתר על כן, ממברנות רגישים להפרעות מכאניות. לפיכך, טכנולוגיות bilayer שומנים הציגו עד כה יישומים מעשיים מוגבלות. 11
על מנת לשפר את חוסנו ואת תוחלת החיים של ממברנות bilayer השומנים, קוסטלו et al. 12, ו אידה Yanagida <sup> 13 פתח bilayer שומנים שעמדו חופשי בתמיכת הידרוג'ל. למרות אריכות ימים משופרים לעומת זאת (<24 שעות), איתנות bilayer לא השתפרו. ג'און et al. 14 פתח קרומי כמוס הידרוג'ל (HEM) עם קשר bilayer הידרוג'ל-שומנים אינטימיים, וכתוצאה מכך אריכות ימים משופרים (עד כמה ימים). כדי להגביר עוד יותר את משך החיים של שולי, Malmstadt ו ג'און et al. נוצר קרום כמוס-הידרוג'ל עם שומנים בדם הידרוג'ל מחייב באמצעות in-situ נטיה קוולנטיים (cgHEM). 15 בשני מערכות, חיים הממברנה גדל באופן משמעותי (> 10 ימים) . עם זאת, מערכות היווצרות קרום לא היו מספיק חזקות, ולא יכולות להיות מאוחסנות או מועברות שבו נדרשו לשחרר מומחיות לשימוש של bilayers השומנים.
פיתוח פלטפורמת bilayer שומנים סבב בעיקר סביב איתנות הגדלת תוחלת חיים של BLMs. למרות תוחלת החיים של BLMs כבר substantially משופר לאחרונה, הבקשות שלהן עדיין מוגבלות בשל חוסר יביל ו storability. כדי להתגבר על בעיות אלה, ג'און et al. יצר מערכת קרום שאפשר לשמור והציג מבשר הממברנה (MP). 16 כדי לבנות MP, הכינו תערובת של decane n- ו hexadecane המכיל 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- SN -glycero-3-phosphatidylcholine) לשלוט נקודת הקיפאון של הפתרון השומנים כך שהוא יקפיא ב ~ 14 ° C (מתחת לטמפרטורת החדר, מעל טמפרטורת המקרר אופייני). בניסוי זה, חבר הפרלמנט התפרש על צמצם קטן על סרט polytetrafluoroethylene (PTFE) ובהמשך קפוא במקרר ב 4 ° C.. כאשר MP הובא לטמפרטורת חדר, חבר הפרלמנט מופשר לבין bilayer שומנים הוקם באופן אוטומטי, ביטול המומחיות הקשורות בדרך כלל היווצרות קרום. עם זאת, שיעור ההצלחה של BLM עשוי MP היה נמוך כמו ~ 27%, ואת קרום formation הזמן היה עקבי (30 דק 'ל -24 שעות), הגבלת היישומים המעשיים שלה.
במחקר זה, polydimethylsiloxane (PDMS) סרט דק משמש במקום סרטים קונבנציונאלי הידרופובי דק (PTFE, polyoxymethylene, קלקר) עד (א) בקרת זמן ייצור (ב) להגדיל את שיעור ההצלחה של היווצרות BLM כפי שדווח בעבר על ידי ריו et al. 17 בזאת, היווצרות קרום התאפשרה על ידי מיצוי בממסים בשל האופי הנקבובי של PDMS, ואת הזמן הנדרש להיווצרות קרום נשלט בהצלחה במחקר זה. במערכת זו, כפתרון השומנים נטמע הסרט הדק PDMS, זמן היווצרות קרום עקבי הושג. יתר על כן, חי קרום הוארכו עקב ספיגה איטית של ממסים לתוך PDMS סרט דק, עקב תוספת הסקוואלין לפתרון השומנים. ערכנו מדידות אופטיות וחשמליות לאמת כי קרומים נוצרו באמצעות טכניקה זו מתאימים iעל מחקרי ערוצים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
- Hanke, W., Schulue, W. . Planar lipid bilayers: methods and applications. , (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
- Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
- Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
- Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
- Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
- Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
- Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
- Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
- Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
- Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
- Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
- Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
- Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
- Yaws, C. . Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , (1999).
- Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. . The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , (1976).
- Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
- Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
- Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
- Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).
