Formation automatisée Lipid bicouche Membrane Utilisation d'un Thin Film Polydiméthylsiloxane
Summary
Nous démontrons un système stockable, transportable lipidique formation bicouche. Une membrane lipidique à deux couches peut être formée à l'intérieur de 1 heure avec un taux de succès supérieur à 80% lors d'un précurseur de membrane congelée est ramené à température ambiante. Ce système permettra de réduire les processus laborieux et expertise associés aux canaux ioniques.
Abstract
Une bicouche lipidique artificielle, ou d'une membrane lipidique noire (BLM), est un outil puissant pour étudier les canaux ioniques et les interactions entre protéines, ainsi que pour les applications de biocapteurs. Cependant, les techniques classiques de formation BLM présentent plusieurs inconvénients et ils nécessitent souvent une expertise spécifique et des processus laborieux. En particulier, BLM classiques souffrent de faibles taux de réussite de la formation et incohérente temps de formation de la membrane. Ici, nous démontrons un système de formation BLM stockable et transportable avec le temps d'éclaircissage contrôlé et amélioré le taux de formation BLM en remplaçant les films classiquement utilisés (polytétrafluoroéthylène, polyoxyméthylène, polystyrène) polydiméthylsiloxane (PDMS). Dans cette expérience, un polymère poreux structuré tel que le PDMS film mince est utilisé. En outre, par opposition aux solvants classiquement utilisés avec une faible viscosité, l'utilisation du squalène a permis un temps d'éclaircissage contrôlée par absorption par un solvant lent PDMS, ce qui prolonge la durée de vie de la membrane. En additioncondition, à l'aide d'un mélange de squalène et de l'hexadécane, du point de la solution lipidique de congélation est augmentée (~ 16 ° C), en outre, des précurseurs membranaires ont été produits qui peuvent être stockés indéfiniment et facilement transportable. Ces précurseurs membranaires ont réduit BLM temps de formation de <1 h et atteint un taux de formation BLM de ~ 80%. Par ailleurs, des expériences de canaux ioniques avec la gramicidine A ont démontré la faisabilité du système membranaire.
Introduction
Membrane artificielle bicouche lipidique ou membrane lipidique noire (BLM), est un outil important pour les mécanismes des membranes cellulaires et des canaux ioniques, élucidant ainsi que pour la compréhension des interactions entre les canaux ioniques et des ions / molécules 1-7 Bien que la méthode patch-clamp. est souvent considéré comme l'étalon-or pour les études de la membrane cellulaire, il est laborieux et exige des opérateurs hautement qualifiés pour des mesures de canaux ioniques. 8 Alors reconstituées artificiellement des membranes bicouches lipidiques ont émergé comme des outils alternatifs pour les études des canaux ioniques, 9,10 ils sont également associés à laborieuse des processus et des compétences spécifiques. Par ailleurs, les membranes sont sensibles aux perturbations mécaniques. Applications pratiques Ainsi, les technologies de bicouches lipidiques introduites à ce jour ont limité. 11
Afin d'améliorer la robustesse et la longévité des membranes de bicouche lipidique, Costello et al. , 12, et Ide et Yanagida <sup> 13 ont mis au point une bicouche lipidique autonome soutenue par hydrogels. Malgré une meilleure longévité cependant (<24 h), bicouche robustesse n'a pas été améliorée. Jeon et al. , 14 mis au point une membrane d'hydrogel enrobé (HEM) avec un hydrogel intime bicouche lipidique de contact, ce qui entraîne une longévité accrue (jusqu'à plusieurs jours). Pour augmenter encore la durée de vie du HEM, Malmstadt et Jeon et al. A créé une membrane d'hydrogel encapsulé avec la liaison hydrogel-lipidique par conjugaison covalente in-situ (cgHEM). 15 Dans les deux systèmes, la durée de vie membranaires ont sensiblement augmenté (> 10 jours) . Cependant, les systèmes de formation des membranes ne sont pas suffisamment robustes, et ne pouvaient pas être stockés ou livrés si nécessaire pour libérer l'expertise pour l'utilisation des bicouches lipidiques.
Le développement d'une plate-forme bicouche lipidique a principalement tourné autour de plus en plus de robustesse et de longévité de BLM. Bien que la longévité de BLM a été substantially améliorée récemment, leurs applications ont été limitées en raison d'un manque de transportabilité et conservabilité. Pour surmonter ces problèmes, Jeon et al. A créé un système de membrane stockable et introduit un précurseur de membrane (MP). 16 Pour construire un député, ils ont préparé un mélange de décane n- et hexadécane contenant 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn – glycéro-3-phosphatidylcholine) pour contrôler le point de la solution lipidique telle qu'elle gèle à ~ 14 ° C ( en dessous de la température ambiante, supérieure à la température typique du réfrigérateur) congélation. Dans cette expérience, le député a été étalée sur une petite ouverture sur un polytétrafluoroéthylène (PTFE) Film et ensuite congelé dans un réfrigérateur à 4 ° C. Lorsque le MP est ramené à température ambiante, le MP décongelé et une bicouche lipidique est formée automatiquement, ce qui élimine l'expertise typiquement associée à la formation de la membrane. Cependant, le taux de succès de BLM fait de la MP était aussi bas que ~ 27%, et la membrane formation temps était incompatible (30 min à 24 h), ce qui limite ses applications pratiques.
Dans cette étude, un polydiméthylsiloxane (PDMS) film mince est utilisé à la place d'un des films classiques hydrophobes minces (PTFE, polyoxyméthylène, polystyrène) à (a) le temps de contrôle de la fabrication et (b) augmenter le taux de formation BLM succès comme rapporté précédemment par Ryu et al. 17 Ici, la formation de la membrane a été facilitée par l' extraction de solvants en raison de la nature poreuse de PDMS, et le temps nécessaire à la formation de la membrane a été contrôlée avec succès dans cette étude. Dans ce système, la solution lipidique a été absorbé dans le film mince PDMS, un temps de formation d'une membrane uniforme a été obtenue. De plus, la durée de vie de la membrane a été prolongée en raison de l'absorption lente des solvants dans les PDMS de film mince, un résultat de l'addition de squalène à la solution lipidique. Nous avons effectué des mesures optiques et électriques pour vérifier que les membranes formées en utilisant cette technique sont appropriés pour isur des études canaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
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