Humane tumor-xenotransplantater er vaskulariseret og infiltreret af celler af museoprindelse under vækstfasen in vivo. For at omgå bias forårsaget af disse kontaminerende celler under nedstrøms analyse, udviklede vi en fremgangsmåde muliggør omfattende udtømning af alle museceller ved magnetisk cellesortering.
Brugen af in vitro-cellelinje modeller til kræftforskning har været et nyttigt redskab. Det er imidlertid blevet vist, at disse modeller ikke pålideligt efterligne patientens tumorer i forskellige assays 1. Humane tumorxenoplantater repræsenterer den gyldne standard med hensyn til tumor biologi, lægemiddelforskning, og metastase forskning 2-4. Tumorxenografter kan afledes af forskellige typer af materiale som tumorcellelinier, tumorvæv fra primære patientens tumorer 4 eller serielt transplanterede tumorer. Når opformeret in vivo, er xenotransplanteret væv infiltreret og vaskulariseret af celler af museoprindelse. Flere faktorer såsom tumor enhed, oprindelsen af xenotransplanteret materiale, vækstrate og region transplantation påvirke sammensætningen og mængden af museceller stede i tumorxenotransplantater. Men selv når disse faktorer holdes konstante, graden af kontaminering muse celle er meget varierende.
Contaminating museceller væsentligt forringe downstream analyser af humane tumorxenoplantater. Som musefibroblaster viser høj plating effektiviteter og spredning satser, de har tendens til at vokse kulturer af humane tumorceller, især langsomt prolifererende subpopulationer. Muse celleafledt DNA, mRNA og protein komponenter kan forspænding nedstrøms genekspression analyse, næste generation sekventering, samt proteomanalyse 5. For at overvinde disse begrænsninger, har vi udviklet en hurtig og nem metode til at isolere uberørte humane tumorceller fra xenotransplanteret tumorvæv. Denne procedure er baseret på omfattende udtømning af celler af museoprindelse ved at kombinere automatiseret væv dissociation med benchtop væv dissociator og magnetisk cellesortering. Her viser vi, at humane målceller kan være kan opnås med renheder højere end 96% inden for mindre end 20 min uafhængigt af tumortype.
Faste humane tumorer består af flere fysiologiske såvel som neoplastiske celletyper. De danner heterogene væv med komplekse biologiske strukturer. Biologiske processer som tumordannelse progression og reaktioner over for behandlinger er endnu ikke fuldt forstået. In vitro cellekultur modeller repræsenterer et nyttigt redskab til at studere og forstå tumor biologi. Men de kan kun delvist spejler strukturer og processer, der findes i tumorvæv. Pålidelige og stabile prækliniske humane tumormodeller er en forudsætning for udviklingen af anti-tumor lægemidler og terapier 4,6 samt for forståelse tumor biologi og interaktionen af tumorceller og deres omgivelser.
Humane tumor xenograftmodeller afledt af primære patient tumorer viser høje relationer til væv oprindelseslandet om histologiske arkitektur, interaktioner med mikro-miljø strukturer, metastatisk potentiale og reaktioner på lægemidler 7 </sup>. Selv når tumorxenografter er afledt fra dyrkede celler eller cellelinier de nærmere efterligner patientens tumorer, derfor viser højere gyldighed i de fleste assays sammenlignet med in vitro-cellekultur modeller. Disse funktioner gør dem guldstandarden af prækliniske modeller 4. Udover dens anvendelse i kræftforskning, er xenotransplantation af humane celler i mus også ofte i stamcelleforskningen at bestemme stemness og differentiering potentiale en målgruppe 8.
Det er blevet vist, at human mikrovaskulatur og humane immunceller erstattes ved in vivo opformering af humane tumorer 2,9. Faktorer som tumor undertype, vækstrate, og region transplantation har store konsekvenser for den globale niveau af infiltration samt sammensætningen af mus celletyper fundet. Men selv når disse faktorer holdes konstante, mængden og sammensætningen af museceller er meget varierende.
Downstream analyser af xenotransplanterede væv bliver ofte udfordret af celler af murin oprindelse. Primære kulturer af humane tumorceller fra xenotransplantater ofte overgroet med fibroblaster. Udover at hæmme dannelsen af tumorcellelinier in vitro, er downstream assays, såsom narkotika cytotoksicitetstestning eller farmakokinetik forspændt siden i silico korrektion for virkninger, der er umulig i de fleste tilfælde kontaminerende museceller. Ud over dette, at kun delvist belyst krydstale mellem musefibroblaster og humane tumorceller har en direkte indvirkning på eksperimentelle resultater af undersøgelser 10. Øvrigt er den mest udbredte uforudsigelige variation af infiltrerende museceller forværrer præcise molekylære downstream analyser. I NGS eller proteomanalyse hver mus-afledte signal målt i stedet for en human tumor signal direkte formindsker sekventering følsomhed. Også microarray baseret udtryk analyser udfordret af murine nucLeic syrer eventuelt cross hybridiserende til humane prober.
For at omgå forhindringer kontaminerende museceller på de efterfølgende analyser af humane tumorceller fra xenograftmodeller er blevet foreslået forskellige tilgange. I mange undersøgelser ønskede target celler til nedstrøms analyse isoleres ved at udnytte markører eller kombinationer af markører udelukkende udtrykt på humane tumorceller. Men manglen på pålidelige markører for positiv identifikation af humane tumorceller udgør ofte en stor forhindring. Selv bredt udtrykte markører, såsom EpCAM på menneskelige carcinomer, viser ofte tumor iboende udtryk forskelle 11. Det øger risikoen for, at lave udtrykker delpopulationer, fx tumorceller gennemgået epitelial-til-mesenkymale overgang, går tabt under isolation. Desuden kan den direkte binding af et selektionsmiddel til målcellen påvirke de efterfølgende analyseresultater. Forsøg på depletterende museceller vedved anvendelse af en kombination af antistoffer specifikke for murint CD45 og MHC klasse I epitoper er også blevet gjort 12. Men denne markør kombination detekterer kun en delmængde af museceller. En anden fremgangsmåde er at forbedre analysere processer ved software. Ikke desto mindre er alle disse tilgange er enten ikke egnet til enhver form for eksperimentel opstilling eller for enhver tumor enhed og transplantation metode.
I denne undersøgelse præsenterer vi en hidtil ukendt og hurtig metode til omfattende nedbrydende museceller fra xenotransplanterede væv uafhængige af muse stamme og væv af oprindelse. I screeninger på flere målorganer og væv til transplantation af xenotransplantater (herunder hud, lunge, hjerne, nyre og skeletmuskulatur) var vi i stand til at identificere en kombination af antistoffer muliggør omfattende detektering museceller. Disse antistoffer blev koblet til superparamagnetiske partikler, titreret og optimeret til depletering ved anvendelse af magnetisk cellesortering. Da kun musespecifikanvendes antistoffer, humane målceller bo "uberørt" og fremgangsmåden er ikke begrænset til xenotransplanted tumorvæv. Vi demonstrerer, at omfattende fjernelse museceller fra xenotransplanterede tumorprøver standardiserer og letter kulturer af humane tumorceller. Desuden viser vi, at analysen af menneskelige tumorxenografter ved næste generation sekventering er væsentligt forbedret. Som det blev observeret denne effekt, selv om en human sekvens specifik udvælgelse er foretaget under exome berigelse, er den indflydelse på hele genomet og hele transkriptom sekventering forventes at blive endnu mere fremtrædende. Tilsammen fjernelse af museceller ved anvendelse af denne nye fremgangsmåde letter dyrkning af humane tumorceller og forbedrer downstream analyser af humane tumor-xenotransplantater.
Vi har udviklet en hurtig og nem metode til isolering uberørte humane tumorceller fra xenotransplanteret tumorvæv. Denne procedure er baseret på omfattende udtømning af celler af museoprindelse ved at kombinere automatiseret væv dissociation og magnetisk cellesortering. Udover udtømning af alle museceller også mængden af døde celler og rester reduceres væsentligt i fraktionen målcellen. Tilsammen denne metode forbedrer markant molekylære downstream analyser og dyrkning af humane tumorceller.
I modsætning til alternative metoder, er der ikke behov for kendskab til tumorcellespecifikke markører, tilpasning til varierende sammensætninger af museceller eller etablering af algoritmer. I denne procedure er uafhængig af muse stamme og tumortype. Derfor er en forspænding gennem isolering af humane tumor subpopulationer på grundlag af enkelte humane specifikke markører, som kan variere i udtryk, som vist for EpCAM 11, er undgåed. Det er endvidere ikke begrænset til tumor materiale, men kan anvendes til enhver form for xenotransplanted væv som museceller målrettes stedet for specifikke humane tumor subpopulationer (data ikke vist).
Omfattende fjernelse af museceller lettes ved at målrette overflade epitoper der udelukkende udtrykkes på celler af museoprindelse. Bortset fra den veletablerede fremgangsmåde til tumor dissociation som præsenteret i denne undersøgelse, er der mange procedurer, der anvender forskellige typer af enzymer. Bevarelse af celleoverflade-epitoper er en forudsætning for denne hidtil ukendte fremgangsmåde, men også for at opnå nøjagtige analyser af humane tumorcellepopulationer. Derfor er det afgørende, at blide enzymer anvendes til fordøjelse af tumorvæv. Således kan muse cellereduktion kun anvendes i kombination med enzymatisk fordøjelse procedurer, som åbenbart ikke påvirker epitoper målrettet under muse-celle depletion procedure. I tvivlstilfælde kan dette kun verificeres af den respektive producent.
<pclass = "jove_content"> Denne metode fungerer også for humane cirkulerende tumorceller (CTCs). Men som frekvenser på målcellerne er sædvanligvis <0,1% fjernelse af museceller kræver desuden lyse af røde blodlegemer og renheder på mere end 50% kan ikke forventes. I dette tilfælde kan muse cellereduktion anvendes som præ-berigelse af CTCs efterfulgt af en berigelse med positive markører (data ikke vist).Fjernelse af museceller forbedrer signifikant dyrkning af humane tumorceller ved at undgå kultur overgrow af musefibroblaster. Desuden er analysen af humane tumor-xenotransplantater af næste generation sekventering væsentligt forbedret og standardiseret. Som det blev observeret denne effekt, selv om en målrettet human sekvens-specifik udvælgelse er foretaget under exome berigelse, er den indflydelse på hele genomet og hele transkriptom sekventering forventes at blive endnu mere fremtrædende.
Desuden er den foreliggende fremgangsmåde letter ACCURAte molekylære studier af tumor subpopulationer inden xenotransplanted humane tumorer. Fjernelse af museceller fra en respektiv prøve i det første trin og efterfølgende sortering humane tumorceller i to forskellige subpopulationer muliggør direkte molekylær sammenligning af tumoren subpopulation af interesse for human bulk-tumorceller 20. Differentiel genekspression mellem tumor celle undertyper kan mere pålideligt vurderes det ikke påvirkes af krydshybridisering af muse-afledte molekyler.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.
Tumor Dissociatio Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Petri dish 100 mm | Various | ||
Scalpel | Various | ||
Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
FBS | Various | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |