मानव ट्यूमर xenografts vascularized और vivo में विकास के चरण के दौरान माउस मूल की कोशिकाओं द्वारा घुसपैठ कर रहे हैं। बहाव के विश्लेषण के दौरान इन contaminating कोशिकाओं की वजह से पूर्वाग्रह को नाकाम करने के लिए, हम एक विधि चुंबकीय सेल छँटाई द्वारा सभी माउस कोशिकाओं की व्यापक कमी की अनुमति के लिए विकसित की है।
कैंसर अनुसंधान के लिए इन विट्रो सेल लाइन मॉडल के उपयोग के लिए एक उपयोगी उपकरण किया गया है। हालांकि, यह दिखाया गया है कि इन मॉडलों को मज़बूती से अलग assays 1 में मरीज के ट्यूमर की नकल करने में विफल। मानव ट्यूमर xenografts ट्यूमर जीव विज्ञान, दवाओं की खोज, और मेटास्टेसिस अनुसंधान 2-4 के संबंध में सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं। ट्यूमर xenografts ट्यूमर सेल लाइनों, प्राथमिक रोगी ट्यूमर 4 या क्रमानुसार प्रत्यारोपित ट्यूमर से ट्यूमर के ऊतक की तरह सामग्री के विभिन्न प्रकार से प्राप्त किया जा सकता है। जब इन विवो में प्रचारित, xenografted ऊतक घुसपैठ और माउस मूल की कोशिकाओं द्वारा vascularized है। इस तरह के ट्यूमर इकाई के रूप में कई कारकों xenografted सामग्री, विकास दर और प्रत्यारोपण के क्षेत्र की मूल संरचना और ट्यूमर xenografts में मौजूद माउस कोशिकाओं की मात्रा को प्रभावित करती है। हालांकि, यहां तक कि जब इन कारकों स्थिर रखा जाता है, माउस सेल संदूषण की डिग्री अत्यधिक चर रहा है।
सहntaminating माउस कोशिकाओं में काफी मानव ट्यूमर xenografts के बहाव के विश्लेषण के ख़राब। माउस fibroblasts उच्च चढ़ाना efficacies और प्रसार दरों शो के रूप में, वे मानव ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृतियों ऊंचा हो जाना, विशेष रूप से धीरे धीरे उप-जनसंख्या proliferating करते हैं। माउस सेल व्युत्पन्न डीएनए, mRNA, और प्रोटीन घटकों कर सकते हैं पूर्वाग्रह बहाव के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, साथ ही proteome विश्लेषण 5। इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम xenografted ट्यूमर के ऊतक से अछूता मानव ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक तेज और आसान तरीका विकसित किया है। यह प्रक्रिया माउस मूल की कोशिकाओं की व्यापक कमी पर benchtop ऊतक dissociator और चुंबकीय सेल छँटाई के साथ स्वचालित ऊतक हदबंदी के संयोजन के द्वारा आधारित है। यहाँ, हम मानव लक्ष्य कोशिकाओं हो सकता है कि कम से कम 20 मिनट के ट्यूमर के प्रकार के स्वतंत्र भीतर के साथ purities अधिक से अधिक 96% प्राप्त किया जा सकता प्रदर्शित करता है।
ठोस मानव ट्यूमर कई शारीरिक के साथ-साथ नवोत्पादित प्रकार की कोशिकाओं से मिलकर बनता है। वे जटिल जैविक संरचनाओं के साथ विषम ऊतकों के रूप में। ट्यूमर गठन, प्रगति की तरह जैविक प्रक्रियाओं और उपचार की दिशा में प्रतिक्रियाओं अभी तक पूरी तरह समझ नहीं रहे हैं। इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल का अध्ययन करने और ट्यूमर जीव विज्ञान को समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, वे केवल आंशिक रूप ढांचे और प्रक्रियाओं ट्यूमर ऊतकों में पाया दर्पण कर सकते हैं। विश्वसनीय और स्थिर preclinical मानव ट्यूमर मॉडल विरोधी ट्यूमर दवाओं और चिकित्सा 4,6 के विकास के लिए और साथ ही ट्यूमर जीव विज्ञान और ट्यूमर कोशिकाओं और उनके पर्यावरण की बातचीत को समझने के लिए एक शर्त है।
मानव ट्यूमर जेनोग्राफ्ट प्राथमिक मरीज के ट्यूमर से निकाली गई मॉडल उच्च दवाओं से 7 सूक्ष्म पर्यावरण संरचनाओं, मेटास्टेटिक क्षमता और प्रतिक्रियाओं के साथ ऊतकीय वास्तुकला के बारे में मूल के ऊतकों को संबंधों, बातचीत दिखाने </sup>। यहां तक कि जब ट्यूमर xenografts संवर्धित कोशिकाओं या सेल लाइनों वे और अधिक बारीकी से मरीज के ट्यूमर की नकल से प्राप्त कर रहे हैं, इसलिए इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल की तुलना में दिखा सबसे assays में उच्च वैधता। इन सुविधाओं के लिए उन्हें preclinical मॉडल 4 के सोने के मानक हैं। कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में अपने आवेदन इसके अलावा, चूहों में मानव कोशिकाओं की xenotransplantation भी बार बार स्टेम सेल अनुसंधान के क्षेत्र में एक लक्षित जनसंख्या 8 की stemness और भेदभाव क्षमता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
ऐसा नहीं है कि मानव microvasculature दिखाया गया है और मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं मानव ट्यूमर 2,9 के vivo प्रचार पर प्रतिस्थापित कर रहे हैं। इस तरह के ट्यूमर उप प्रकार, विकास दर, और प्रत्यारोपण के क्षेत्र के रूप में कारक घुसपैठ की वैश्विक स्तर पर प्रमुख प्रभाव के रूप में अच्छी तरह के रूप में पाया माउस प्रकार की कोशिकाओं की संरचना की है। हालांकि, यहां तक कि जब इन कारकों स्थिर रखा जाता है, राशि और माउस कोशिकाओं की संरचना अत्यधिक चर रहे हैं।
xenografted ऊतकों के बहाव के विश्लेषण अक्सर murine मूल की कोशिकाओं द्वारा चुनौती दी है। xenografts से मानव ट्यूमर कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों अक्सर fibroblasts द्वारा ऊंचा हो जाता है। इन विट्रो में ट्यूमर सेल लाइनों की पीढ़ी में बाधा इसके अलावा, ऐसी दवा cytotoxicity परीक्षण या फार्माकोकाइनेटिक्स के रूप में नीचे की ओर assays से माउस कोशिकाओं को दूषित ज्यादातर मामलों में असंभव है होने वाले प्रभाव के लिए सिलिको सुधार के बाद से पक्षपाती हैं। इसके अलावा, केवल आंशिक रूप से elucidated माउस fibroblasts और मानव ट्यूमर कोशिकाओं के बीच परस्पर बात अध्ययनों से 10 की प्रयोगात्मक परिणामों पर सीधा प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, माउस कोशिकाओं में घुसपैठ की सबसे व्यापक रूप से अप्रत्याशित बदलाव सटीक आणविक बहाव के विश्लेषण aggravates। NGS या proteome में प्रत्येक माउस व्युत्पन्न संकेत एक मानव ट्यूमर के संकेत के बजाय मापा विश्लेषण सीधे अनुक्रमण संवेदनशीलता कम हो जाती है। इसके अलावा माइक्रोएरे आधारित अभिव्यक्ति विश्लेषण murine NUC ने चुनौती दी हैleic एसिड मानव जांच करने के लिए संभवतः पार hybridizing।
आदेश में मानव ट्यूमर कोशिकाओं के बहाव के विश्लेषण जेनोग्राफ्ट मॉडल से अलग अलग दृष्टिकोण प्रस्तावित किया गया है में माउस कोशिकाओं contaminating की बाधाओं को दरकिनार करने में। कई अध्ययनों में नीचे की ओर विश्लेषण के लिए वांछित लक्ष्य कोशिकाओं मार्कर या मार्कर के संयोजन विशेष रूप से मानव ट्यूमर कोशिकाओं पर व्यक्त उपयोग के द्वारा अलग कर रहे हैं। बहरहाल, मानव ट्यूमर कोशिकाओं के सकारात्मक पहचान के लिए विश्वसनीय मार्कर की कमी अक्सर एक बड़ी बाधा का प्रतिनिधित्व करता है। ऐसे मानव कार्सिनोमा पर EpCAM के रूप में भी मोटे तौर पर व्यक्त मार्कर, अक्सर ट्यूमर आंतरिक अभिव्यक्ति मतभेद 11 दिखा। यह जोखिम है कि कम व्यक्त उप-जनसंख्या, जैसे, ट्यूमर कोशिकाओं से गुजरा उपकला करने वाली mesenchymal संक्रमण, अलगाव के दौरान खो रहे हैं बढ़ जाती है। इसके अलावा, लक्ष्य सेल करने के लिए एक चयन एजेंट के प्रत्यक्ष बाध्यकारी बाद के विश्लेषण के परिणामों को प्रभावित कर सकता है। द्वारा माउस कोशिकाओं घट का प्रयासmurine CD45 और MHC वर्ग मैं epitopes के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के संयोजन का उपयोग भी 12 बनाया गया है। हालांकि, इस मार्कर संयोजन केवल माउस कोशिकाओं के एक सबसेट का पता लगाता है। एक और दृष्टिकोण सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण की प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए है। फिर भी, इन सभी दृष्टिकोणों या तो प्रयोगात्मक स्थापना के किसी भी प्रकार के ट्यूमर या किसी भी इकाई और प्रत्यारोपण विधि के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
इस अध्ययन में हम व्यापक माउस तनाव और मूल के ऊतकों की स्वतंत्र xenografted ऊतकों से माउस कोशिकाओं घट के लिए एक उपन्यास और तेज तरीका मौजूद है। एकाधिक लक्ष्य अंगों और xenografts (त्वचा, फेफड़े, मस्तिष्क, गुर्दे और कंकाल की मांसपेशी सहित) के प्रत्यारोपण के लिए ऊतकों पर स्क्रीनिंग में हम व्यापक माउस कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अनुमति एंटीबॉडी का एक संयोजन की पहचान करने में सक्षम थे। ये एंटीबॉडी, superparamagnetic कणों को मिलकर titrated और चुंबकीय सेल छँटाई का उपयोग करके कमी के लिए अनुकूलित किया गया। के रूप में केवल माउस के विशिष्टएंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे हैं, मानव लक्ष्य कोशिकाओं "अछूता" रहने के लिए और विधि xenotransplanted ट्यूमर के ऊतक तक सीमित नहीं है। से xenografted ट्यूमर के नमूनों का मानकीकरण और मानव ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृतियों की सुविधा हम उस व्यापक हटाने माउस कोशिकाओं प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, हम बताते हैं कि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा मानव ट्यूमर xenografts के विश्लेषण में काफी सुधार हुआ है। हालांकि एक मानव अनुक्रम विशिष्ट चयन exome संवर्धन के दौरान बाहर किया गया है जैसा कि इस प्रभाव देखा गया, पूरे जीनोम और पूरे transcriptome अनुक्रमण पर प्रभाव भी अधिक महत्वपूर्ण होने की उम्मीद कर रहे हैं। साथ में ले ली, इस उपन्यास विधि का उपयोग माउस कोशिकाओं को हटाने मानव ट्यूमर कोशिकाओं की खेती की सुविधा और काफी मानव ट्यूमर xenografts के बहाव के विश्लेषण में सुधार।
हम xenografted ट्यूमर के ऊतक से अछूता मानव ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक तेज और आसान तरीका विकसित किया है। यह प्रक्रिया माउस मूल की कोशिकाओं की व्यापक कमी पर स्वचालित ऊतक हदबंदी और चुंबकीय सेल छँटाई के संयोजन से आधारित है। यह भी सभी माउस कोशिकाओं मृत कोशिकाओं और मलबे की राशि की कमी के अलावा काफी लक्ष्य सेल अंश में कम हो जाता है। साथ में ले ली, इस विधि काफी आणविक बहाव के विश्लेषण और मानव ट्यूमर कोशिकाओं की खेती में सुधार।
वैकल्पिक तरीकों के विपरीत, ट्यूमर सेल विशिष्ट मार्करों, माउस कोशिकाओं या एल्गोरिदम की स्थापना की रचनाओं अलग-अलग करने के लिए समायोजन के ज्ञान के लिए कोई जरूरत नहीं है। प्रस्तुत विधि माउस तनाव और ट्यूमर के प्रकार के स्वतंत्र है। इसलिए, एक मानव विशिष्ट मार्करों के आधार के रूप में EpCAM 11 के लिए दिखाया गया है जो अभिव्यक्ति में भिन्न हो सकते हैं, पर मानव ट्यूमर उप-जनसंख्या के अलगाव के माध्यम से एक पूर्वाग्रह, से बचनेईडी। इसके अलावा, यह ट्यूमर सामग्री तक ही सीमित नहीं है, बल्कि xenotransplanted ऊतक के किसी भी प्रकार के रूप में माउस कोशिकाओं विशिष्ट मानव ट्यूमर उप-जनसंख्या के बजाय लक्षित कर रहे हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया।
माउस कोशिकाओं के व्यापक हटाने सतह epitopes विशेष रूप से माउस मूल की कोशिकाओं पर व्यक्त लक्षित करने से मदद की है। इसके अलावा इस अध्ययन में प्रस्तुत के रूप में ट्यूमर हदबंदी के लिए अच्छी तरह से स्थापित विधि से, वहाँ कई प्रक्रियाओं एंजाइमों के विभिन्न प्रकार के प्रयोग कर रहे हैं। कोशिका की सतह epitopes के संरक्षण के इस उपन्यास विधि के लिए, लेकिन यह भी मानव ट्यूमर सेल आबादी का सटीक विश्लेषण के लिए एक शर्त है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि कोमल एंजाइमों ट्यूमर के ऊतक के पाचन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इस प्रकार, माउस सेल कमी केवल enzymatic पाचन प्रक्रिया है कि जाहिर माउस सेल कमी प्रक्रिया के दौरान लक्षित epitopes को प्रभावित नहीं करते के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है। संदेह की स्थिति में यह केवल संबंधित निर्माता द्वारा सत्यापित किया जा सकता है।
<pवर्ग = "jove_content"> इस विधि को भी मानव घूम ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) के लिए काम करता है। हालांकि, के रूप में लक्ष्य कोशिकाओं की आवृत्तियों रहे हैं आमतौर पर <माउस कोशिकाओं के 0.1% हटाने इसके अतिरिक्त लाल रक्त सेल और 50% से अधिक की शुद्धता की आवश्यकता की उम्मीद नहीं की जा सकती। इस मामले में, माउस सेल कमी एक संवर्धन सकारात्मक मार्कर का उपयोग करके किया CTCs की पूर्व संवर्धन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया।माउस कोशिकाओं को हटाने में काफी माउस fibroblasts की संस्कृति ऊंचा हो जाना बचने के द्वारा मानव ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृति में सुधार। इसके अलावा, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा मानव ट्यूमर xenografts के विश्लेषण में काफी सुधार हुआ है और मानकीकृत है। हालांकि एक लक्षित मानव अनुक्रम विशिष्ट चयन exome संवर्धन के दौरान बाहर किया गया है जैसा कि इस प्रभाव देखा गया, पूरे जीनोम और पूरे transcriptome अनुक्रमण पर प्रभाव भी अधिक महत्वपूर्ण होने की उम्मीद कर रहे हैं।
इसके अलावा, प्रस्तुत विधि ACCURA की सुविधाxenotransplanted मानव ट्यूमर के भीतर ट्यूमर उप-जनसंख्या के ते आणविक अध्ययन करता है। पहले चरण में एक संबंधित नमूना से माउस कोशिकाओं को हटाने और बाद में दो अलग-अलग उप-जनसंख्या में मानव ट्यूमर कोशिकाओं छँटाई मानव थोक ट्यूमर कोशिकाओं को 20 के हित के ट्यूमर उप-जनसंख्या का सीधा आणविक तुलना में सक्षम बनाता है। ट्यूमर सेल उपप्रकार के बीच अंतर जीन अभिव्यक्ति अधिक मज़बूती से मूल्यांकन किया जा सकता है क्योंकि यह माउस व्युत्पन्न अणुओं के पार संकरण से प्रभावित नहीं है।
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.
Tumor Dissociatio Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Petri dish 100 mm | Various | ||
Scalpel | Various | ||
Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
FBS | Various | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |