Introduction
眼球と対向する2ミリメートル狭い結膜地域-人間の上まぶたはわずか1で、毎日1約1万点滅を実行します。まばたきの間のワイピング動作による、眼瞼縁のこの部分は、「蓋ワイパー「領域2と呼ばれています。摩擦が原因で地球上ワイピング蓋に、常習的な点滅の間にこの領域で増加することが想定されます。これは、眼の快適で重要な役割を果たしている可能性があります。特定の経験眼の不快感のコンタクトレンズ装用者、これは3を着用レンズを停止するための主要な理由の一つです。コンタクトレンズが眼に配置されると、レンズ材料と眼の表面との間の摩擦係数を4に変更することが示されています。乾燥状態の症状は、この変更された摩擦2,5,6-に関連することができることを示唆する証拠があります。
この関連付けはまた、臨床的に観察現象に反映される可能性があり、特に蓋のwi上皮症（LWE）あたり、また上蓋マージン染色（ULMS）6と呼ばれます。 LWEは、眼の刺激の初期兆候とドライアイ疾患のための潜在的な予測因子です。これは、観察された上下の眼瞼縁の領域の生体染色によって測定されます。このグレーディングシステム2とその臨床的妥当性（自覚症状を持つ、すなわち、相関が）議論の下にまだあるが、眼の不快感は、最も重要なのは、患者にとって不便似臨床医と科学者のための難問のままと。
現在まで、少しは蓋ワイパー領域7の（サブ）携帯解剖学と生理学において臨床的に関連のバリエーションについては知られており、1つのレポートだけでは細胞学的方法8を利用します。印象細胞診（IC）は、膜9,10の適用によって眼球や瞼板結膜の上皮表面から細胞を収集するために40年以上にわたって使用されています。除去の際、接着細胞は、cを受けますytological染色および顕微鏡イメージング。蓋ワイパー領域における解剖学的および細胞性の違いのために、この技術は、最適化を必要とします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
倫理の声明：ヒト被験者、インフォームドコンセントと倫理の承認から細胞を採取する前に取得する必要があります。
1.ステインを準備
注：実験日の汚れを準備します。
- 15mlの遠心チューブに2.5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に5μlのエチジウム（または4μM）および5μlのカルセインAM（または4μM）を追加します。ミックス。使用するまで室温で光とストアから遮蔽するためにアルミホイルで包みます。
2.細胞を回収
- そのパッケージから細胞培養インサートを取り外し、各まぶたをサンプリングするためにラベルを付けます。永久的なマーカーを用いた膜プラスチックホルダー側の細胞収集のマークの向き。 ICを受ける地域の適切な健康状態を確認するために、適度な倍率（約20倍）で、スリットランプ検査を実施します。
- EAの下結膜嚢に局所麻酔薬（0.5％プロパラカイン塩酸塩）の1滴を分配chの目と目を保つために、参加者に指示するには、1分間閉じました。
- エバート上部眼瞼とまつ毛により所定の位置に保持します。蓋ワイパー領域との接触を避けます。
オプション：第二研究者の援助は、この手順を実行する必要があります。 - 最小限の圧力で蓋ワイパー領域の中央部に垂直に膜を適用します。
- 5秒 - 3のための場所で膜を保持します。接触領域に半透明になった膜を観察します。この時点で、優しく膜を除去し、元の位置に戻し、「フリップ」に参加者のふたを可能にします。
- 速やかに乾燥するのを防止するために、サンプルをPBSの一滴を適用します。膜は半透明に変わり、これが乾燥を示すように、いつでも不透明回すべきではありません。二次調査員は、サンプルの処理（セクション3）ですぐに進んでいます。
- 結膜の整合性を確保するために、最終的な眼の検査を実施します。眼潤滑剤を分配し、参加者に指示麻酔効果が切れるまで、彼らの目をこすり避けるために（約15分）。
3.サンプル処理
- マイクロはさみを使用して、垂直な細胞採取の中央から、半分（下流の分析のそれぞれに1つの半分）で膜をカット。プラスチック製のホルダーからそれを分離するための一つの膜半分の外縁に沿って切断。膜は、それ自体の上に折り畳まないことを保証を含む膜上に収集された細胞との相互作用を避けます。
- 完全ホルダーから取り外す前に、ピンセットを用いて膜を固定します。 95％（v / v）エタノールを500μlを含む標識2 ml遠心チューブに膜を置き、（セクション4.2）を処理する前に、2時間の最大20分の最低固定するために残します。
- すぐに（セクション3.2で説明したように）膜の第二の半分を分離し、速やかにセクション4.1に進んでください。
4.サンプル染色
- ImmunocytochemiCAL染色
- 慎重に収集側を下に向けて35ミリメートルのガラスボトム培養皿に膜を置きます。膜が平坦であることを確認します。
- 膜へのセクション1で組み立てられた免疫細胞化学的染色組成物のピペットを20μl。サンプルカールアップは、慎重にその縁部を押し下げることにより膜を平坦化する使い捨てのピペットチップを使用している場合。細胞収集領域との接触を避けます。
- ゆっくりとガラスカバースリップでメンブレンをカバーしています。サンプルの無駄な動きを避けてください。蓋付き皿を覆い、エッジの周りラボ・フィルムで密封します。ディッシュ（上部と下部）と試料の可視性の透明性を妨げないでください。ラボのマーカーでラベルを付けます。
- すぐにイメージング（セクション5.1）に進み、その後、膜の他の半分の細胞学的染色を継続するためにセクション4.2に戻ります。
- 細胞学的染色
- 徐々にゆっくりとチューブのuに蒸留水500μLを加えることによって膜を水和セクション3.4に固定するためのsed。中身を取り出した後、混合するピペットチップに吸引する内容を数回。
- 蒸留水500μLを加えます。削除した後、数秒間放置します。アルシアンブルー染色の500μLを加え、3分間のまま。汚れを削除し、3回連続500μlの蒸留水リンスや液体が透明にリンスするまで行います。
- ヘマトキシリン＃1染色の500μLを加え、3分間のまま。汚れを削除して、液体が透明リンスまで水リンスを蒸留または3回連続500μLを行います。透明な液体を吸引することにより、（セクション4.2.1の逆）を脱水。
- パパニコロウOG-6染色の500μLを加え、3分間のまま。汚れを削除し、1500μlの95％（v / v）エタノールリンスを行います。
- パパニコロウEA-65染色の500μLを加え、3分間のまま。汚れを削除し、（v / v）エタノールリンスの連続した3500μlの95％を実行します。
- 完全に3回連続500μlの100％エタノールリンスを使用して脱水します。 TWEを使用しましたezers、溶液から試料を取り出します。感動細胞収集領域を避けます。
- スライドガラス上に膜を置きます。そのセルのコレクションラインを確保することは、並列またはイメージング中に容易に位置合わせのためのマージンをスライドする垂直のいずれかです。
- 100％エタノールのドロップを適用し、ガラススリップでカバーしています。すぐにイメージング（5.2節）に進みます。
5.サンプル画像
- イメージング蛍光免疫組織化学染色
- 画像取得ソフトウェアを実行しているコンピュータに接続されたデジタルカラーカメラを装備した11または蛍光顕微鏡12、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を使用します。培養皿内に含まれるサンプルに、倒立顕微鏡を必要とすることができます。
- エチジウムホモダイマー-1（DNAの存在下で、617分の528 nmのEX /エム最大値）の吸収スペクトルおよび発光スペクトルとカルセインAM（517分の494 nmのEに係る顕微鏡11,12を設定しますX /エム最大値）。
- （ 例えば、2.5倍対物レンズ）顕微鏡で最も低い倍率を選択し、デジタルイメージングシステムを活性化させます。コンピュータのモニタ上に表示された試料を観察します。
- 目的の細胞機能のサンプルを検査します。
- 希望顕微鏡の倍率を選択し、イメージングソフトウェアを使用して画像を取得します。
- ネイティブ顕微鏡ファイル形式または非圧縮ファイル形式（ 例えば 、*の.raw、* .TIFF）のいずれかでファイルを保存します。
- イメージング細胞学的染色
- 画像取得ソフトウェアを実行しているコンピュータに接続されたデジタルカラーカメラを装備していないフィルタを備えた標準的な実験明視野顕微鏡を、使用してください。
- 顕微鏡ステージ上に配置し（ステップ4.2.8から）ロックスライドガラス。必要に応じて、全体のイメージング手順を通して、100％エタノールで試料を再水和します。
- （ 例えば 、2.5倍対物レンズ）顕微鏡で最も低い倍率を選択して、目を活性化させますEデジタルイメージングシステム。コンピュータのモニタ上に表示された試料を観察します。
- 確保細胞収集は、顕微鏡ステージ制御のXまたはY軸のいずれかと整列されます。カバースリップを除去し、ピペットチップやピンセットを用いて試料を回転させることにより、必要に応じて調整してください。
- イメージングソフトウェアを使用して、最低の顕微鏡倍率で試料全体の画像（複数可）を取り込みます。
- 適度な顕微鏡倍率（ 例えば、10 - 20X対物レンズ）に切り替えて、顕微鏡の光源とソフトウェア撮影パラメータ（露出、コントラスト、ホワイトバランスなど ）を調整し、その自動化されたソフトウェアメータリングを無効にします。将来の使用のためにこれらの設定を保存します。
- スキャンの開始点と終了点（細胞採取の例えば 、左上と右下の角）を決定します。
- イメージングソフトウェアを使用して、始点と終点内全体細胞収集領域の画像（複数可）を取り込みます。 betw 20％の側サイドと上から下への重複を確認してくださいすべての隣接する画像EEN。
- ネイティブ顕微鏡ファイル形式または非圧縮ファイル形式（ 例えば 、*の.raw、* .TIFF）を使用してファイルを保存します。
- （ 例えば、アドビPhotoshop Elementsの）選択肢の自動ステッチソフトウェアを使用して、最終的なパノラマ画像を生成します。最終的な画像に自動化されたステッチの精度を確認するために、ステップ5.2.5で撮影された参照画像）を使用します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
プラスチックホルダーの上に張られた細胞培養膜は、蓋ワイパー結膜からの上皮細胞のハンドヘルド収集のための便利なツールです。この方法は、典型的には、IC膜を作製し、処理するために使用される追加の滅菌器具の必要性を排除する。 図1は、細胞培養インサートを使用して、蓋ワイパー領域のICを示します。我々は、新規な方法で蓋ワイパー領域から上皮細胞を特徴付けるために互いに補完つの異なる染色プロトコルを最適化しました。 図2に示すように、蛍光免疫細胞化学染料は、エステラーゼ活性、細胞生存率の指標、および核酸を明らかにするの染色は細胞膜の妥協を反映した。細胞学的染色プロトコルは、角質化度との間の微細な区別を可能にする。 図3は、遷移を示します眼瞼結膜における低角化と高度なケラチンの間蓋ワイパー結膜および表皮中化。関心の選択された領域とは対照的に、細胞診染色細胞のコレクションのパノラマ撮影は、コレクション全体領域の分析が可能になります。画像解像度は、核のレベルにズームするには十分です。細胞形態を正確に判断することができる。 図4は、約使用縫合、細胞学的に染色された細胞のコレクションの最終的な画像を示しています。 100独立した高解像度のファイル。これらのツールは、新規な方法で、摩擦および/またはドライアイの効果を評価するために使用され得ます。
蓋ワイパーエリアの図1.印象細胞診。上蓋の外転によって公開された蓋ワイパー領域に対して行わ印象細胞診。使用される膜は、セルカルチャーインサート、12ミリメートル、親水性PTFEです。前とは違って保持することができる膜ホルダーのタブ（注彼らは狭い眼瞼縁への膜の適用を妨げないと実際の位置合わせを助けることができるように、彼らは）アプリケーションの前に除去された眼球結膜、上vious研究。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
蓋ワイパー領域から図2蛍光細胞大きな扁平上皮細胞間の細胞形態の変化を示す共焦点レーザー走査顕微鏡 （a）と小さい立方体様/円柱細胞（B）。カルセインAMの緑色蛍光は、細胞体（ すなわち 、細胞の生存率）にエステラーゼ活性を示します。エチジウムの赤色蛍光は、細胞膜の妥協を示す、核酸を明らかにする。少数の細胞は、おそらくで、強烈な緑と赤なし蛍光を示します細胞膜の完全性（C）のdicative。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ICのサンプルの図3.細胞学的染色。形態と異なる角化度を変化させ、蓋ワイパー領域ショーの細胞。マージナル/眼瞼結膜に見られる大きな核、と、小さな円柱と立方体様細胞の青色は、何の角質化がないことを示す（a）は、粘膜皮膚接合（MCJ /マルクスライン）と表皮の無核細胞の凝縮核を有する大きな扁平上皮細胞の赤/オレンジ色の染色は、高度な角化（c）を表しています。蓋ワイパー結膜領域における過渡色（赤/青）、細胞の形態は角質化を限定することをお勧め（B）。g3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
蓋ワイパー細胞採取の図4.合成画像。細胞学的染色後の蓋ワイパーエリアの印象細胞診。画像は約使用して一緒にステッチ。 100個々の写真は、顕微鏡および20X対物レンズで撮影しました。 （a）はマージナル/眼瞼結膜の小さな立方体様/円柱上皮細胞。ここでの細胞は全く角化がないことを示す青/緑/紫の色を呈します。 （b）は領域（a）と（c）との間の形態および染色の色の移行蓋ワイパー結膜の細胞。 （c）の粘膜皮膚接合/マルクスラインの大きな扁平上皮細胞。オレンジ染色の色は、角質化のいくつかの程度を示す、赤/ピンク後期扁平上皮の移行を示しています。 （d）のMeibum印象。 （e）に無核、表皮の角化細胞; （F）Goblet細胞印象や涙液膜のムチン。下向きの矢印は眼瞼結膜の領域を示し、上向きの矢印は外蓋を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
印象の細胞学は、典型的には、混合セルロースエステル膜を用いて、眼球結膜上で実行されます。サンプルは、バルク材料のシートのサイズに切断し、滅菌、適用及び鉗子を使用して、結膜の表面から除去されます。同一の膜材料を用い、ピストン制御ICデバイスは、最近眼球結膜の表面形状に適合するように設計されており、アプリケーション13との間の一貫した圧力を維持しました。これらのアプローチは、（ 図1を参照）、狭い、顕著に湾曲した蓋ワイパー領域について非効率的です。また、混合セルロースエステル膜は、明視野顕微鏡は、蛍光イメージングの前にサンプルを整列させる必要があるセットアップのために必要な透明性を提供していません。このプロトコルで提案されている細胞培養インサートは、それらが滅菌されているので、理想的なサイズ便利でかつ迅速な収集を確実さらに設備なしに、手動で取り扱うことができます。膜は、から作られています共焦点顕微鏡分析のために十分な透明性を提供する親水性PTFE、。
全体的に、収集された細胞の形態学的特徴は、以前の文献報告7,8,14,15と一致します。その後のパパニコロウが7,8前に報告されたものより、携帯角化レベルでのより詳細な視点を可能にする、より細かい色変動を表示するには、染料のためにアルシアンブルーで一般的に使用される（と色彩非常に強い）過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色を交換することができます。
細胞学的サンプルの顕微鏡イメージングは、通常、接眼レンズを通して目視検査が関与し、「興味のある」とみなされる構造の高倍率撮影。このアプローチでは、コレクション全体の「大きな絵」の側面が失われる可能性があります。低倍率のショットは、通常、（ 等によるケラレ、収差に）劣った光学的品質のであり、解像度は、携帯ディテールを描写するには不十分です秒。それは完全な膜の概要だけでなく、すべて一つの画像に、原子力詳細にズームインする能力を提供するように少しより多くの時間がかかるが、有利である一方で、パノラマステッチプロトコルは、ここで提案しました。そのような細胞数などの量的指標は、核-細胞質（NC）比16との距離は、ここで算出することができます。
正しい結膜上の膜のアプリケーション（セクション2.4）、サンプル処理ステップ間のタイミング（セクション2.6および3〜5）、最適なパノラマステッチのための一貫性のある撮像パラメータ（セクション5.2：特別な注意を必要とするプロトコル内の3つの重要なステップがあります。 0.6 - 5.2.8）。表皮と瞼溝との間に2ミリメートル - 比較的平坦な眼球結膜とは異なり、地域ワイパー蓋が1つだけの狭い幅にまたがる、顕著な曲率を有します。これは非常に収集された細胞のタイプに影響を与えることができるように、膜が適切な角度で適用することが必須です。第二に、MEMブレーン圧力は、アプリケーション間の一貫性であるべきです。研究者は、したがって、反復可能なコレクションを確保するために必要な器用さを開発する必要があります。サンプルはインプレッションサイトロジー技術を用いて収集されると、処理のタイミングが重要となります。サンプル乾くことを許可すべきではない、 すなわち、膜が不透明（セクション2.6、3〜5）になってはなりません。細胞学的染色を受けるサンプルが長期間固定液中に放置することができますが（20分 - 2時間）、免疫細胞化学染色はできるだけ正確に細胞の生存率を評価するために、遅滞なく追加され、画像化されるべきです。タイミングの一貫性は、サンプル間の比較可能な結果を得るためにも不可欠です。 1は、すべてのサンプルを比較するために等しく、固定および染色時間を維持することを目指すべきです。最後に、細胞学的試料の定性的なパノラマ画像を得るためには、すべての撮影パラメータ（顕微鏡光強度、カメラの露出、コントラスト、ホワイトバランス、 など ）関心の特徴（ すなわち、細胞型）の最高の多様性、およびすべての自動計量で、サンプルの代表的な領域にキャリブレーションを行う必要があり、後続のショット（セクション5.2.6）のために無効にすること。研究者はまた、顕微鏡ステージのX軸またはY軸のいずれかに沿って細胞収集を配向することを目指すべきです。これは、画像取得及び綴じ処理を容易にします。見つけて、隣接する画像間の重複領域における試料（ 例えば、細胞パッチ、meibum、破片など ）に特徴的な機能を使用することを目指しています。顕微鏡の焦点は、ショット間補正すべき調整のみでなければなりません。
元々蓋ワイパー細胞のコンフルエントなパッチを得るために67％の成功率を報告Jalbert 8で観察されるように、この手法の限界は、細胞コレクションの変動です。アプリケーション角が収集された細胞の数とタイプを決定します。この段階では、ワット不明ですhether収集品質（ すなわち、試料上の細胞数）眼の健康と相関しています。より大きなサンプルサイズでの臨床試験は、この手法の有効性を証明するために必要です。さらなる欠点は、IC技術自体の固有の侵襲性です。優れた細胞層を強制的に結膜から除去され、これは、損傷を誘発することができます。免疫細胞化学的汚れが細胞生存率（及びエステラーゼ活性は、すべてのコレクション内に存在する）を反映することが意図されているが、それは不明であるものを私たちのコレクションに細胞核の赤色蛍光を示します。時折、meibum（眼瞼縁で分泌すなわち、脂質）および眼の表面または涙液層から、他のコンポーネントは、細胞の機能をカバーし、解析が困難または不可能にする傾向があります。プロトコルはmeibumの脂質を除去するためにキシレン中で追加のリンスで修正することができます。最後に、結膜細胞に麻酔液滴の効果は不明です。
蓋ワイパー領域の細胞構造のデータを得ることは、これらの細胞および眼表面、および主観的な快適さとの間に生じる摩擦力との相関関係を確認するのに役立ちます。これは貴重な知識を提供し、うまくいけば、眼の不快感のトピックに光を当てるために、無症候性の被験者とは対照的に、蓋ワイパー上皮症、ドライアイや乾燥の症状を有する被験者を、コンタクトレンズ装用者の携帯特殊性を探るために、将来の臨床試験を可能にします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D.
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M.
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
