الانطباع علم الخلايا من منطقة ممسحة غطاء

Published: August 9, 2016 doi: 10.3791/54261

Alex Muntz¹, Kevin van Doorn¹, Lakshman N. Subbaraman¹, Lyndon W. Jones¹

¹Centre for Contact Lens Research, University of Waterloo

Introduction

الجفن العلوي البشري ينفذ حوالي 10،000 يومض كل يوم ^1، مع مجرد 1 - المنطقة الملتحمة 2 مم الضيقة معارضة العالم العين. بسبب حركة المسح له خلال طرفة، وقد أطلق على هذا الجزء من هامش غطاء "غطاء ممسحة" المنطقة ^2. ومن المفترض أن يتم زيادة الاحتكاك في هذه المنطقة خلال الوميض المعتاد، وذلك بسبب الغطاء محو أنحاء العالم. هذا قد لعب دورا هاما في راحة العين. يضعون العدسات اللاصقة في تجربة معينة عدم الراحة في العين وهذا هو واحد من الأسباب الرئيسية لوقف عدسة ارتداء ^3. عندما يتم وضع العدسات اللاصقة على العين، وقد تبين أن معامل الاحتكاك بين المواد العدسة وسطح العين لتغيير ^4. هناك أدلة تشير إلى أن أعراض جفاف يمكن أن تكون ذات صلة في هذا الاحتكاك تغير ^2،5،6.

هذا الارتباط يمكن أيضا أن تنعكس في الظواهر الملحوظة سريريا، ولا سيما واي غطاءفي epitheliopathy (LWE)، وتسمى أيضا الجفن العلوي هامش تلطيخ (ULMS) ^6. LWE هو علامة مبكرة من تهيج العين ومؤشرا محتملا لمرض العين الجافة. لوحظ ويقاس تلطيخ حيوي من المناطق حافة الجفن العلوي والسفلي. في حين أن هذا نظام الدرجات ² و صحة السريرية (أي، والارتباط مع أعراض ذاتية) لا تزال قيد المناقشة، لا يزال عدم الراحة في العين معضلة بالنسبة للأطباء والعلماء على حد سواء، والأهم، مصدر إزعاج للمرضى.

حتى تاريخه، لا يعرف إلا القليل عن الاختلافات سريريا ذات الصلة في (شبه) التشريح الخلوي وعلم وظائف الأعضاء من منطقة ممسحة غطاء ⁷ وتقرير واحد فقط يجعل من استخدام أساليب الخلوي ^8. وقد استخدمت الانطباع علم الخلايا (IC) لأكثر من 40 عاما لجمع الخلايا من سطح الظهارية من الصلبية أو الملتحمة الجفنية من خلال تطبيق غشاء ^9،10. عند إزالتها، فإن الخلايا الملتصقة تخضع جتلطيخ ytological والتصوير المجهري. نظرا للاختلافات التشريحية والخلوية في المنطقة ممسحة غطاء، وهذا الأسلوب يتطلب الأمثل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الأخلاق بيان: قبل جمع الخلايا من المواد البشرية، عن علم ويجب الحصول على موافقة الأخلاق.

1. إعداد وصمة عار

ملاحظة: تعد وصمة عار في يوم من التجربة.

إضافة 5 ميكرولتر إيثيديوم (أو 4 ميكرومتر) و 5 ميكرولتر Calcein AM (أو 4 ميكرومتر) إلى 2.5 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 15 مل أنبوب الطرد المركزي. مزج. التفاف في رقائق الألومنيوم لحمايتها من ضوء وتخزينها في RT حتى الاستخدام.

2. خلايا اجمع

إزالة إدراج ثقافة خلية من حزمة وتسمية كل جفن لأخذ عينات. التوجه علامة جمع الخلية على جانب صاحب غشاء البلاستيك باستخدام علامة دائمة. شق سلوك التفتيش مصباح في تضخم معتدل (حوالي 20X) لتأكيد الصحية المناسبة للمنطقة للخضوع IC.
الاستغناء عن قطرة واحدة من مخدر موضعي (0.5٪ بروباراكايين هيدروكلوريد) في كيس الملتحمة السفلي من عصامالفصل العين وإرشاد المشاركين للحفاظ على عيون مغلقة لمدة دقيقة واحدة.
إيفرت الجفن العلوي وعقد في مكان من قبل جلدة. تجنب أي اتصال مع منطقة غطاء ممسحة.
قد تكون هناك حاجة لمساعدات محقق الثانوية لتنفيذ هذه الخطوة: اختياري.
تطبيق غشاء عموديا على الجزء الأوسط من المنطقة ممسحة غطاء مع الحد الأدنى من الضغط.
عقد الغشاء في مكان 3-5 ثانية. مراقبة غشاء تصبح شفافة في مجال الاتصال. في هذه المرحلة، وإزالة بلطف الغشاء وتسمح غطاء المشارك في "الوجه" العودة الى المكان.
تطبيق فورا قطرة واحدة من برنامج تلفزيوني للعينة، لمنعها من الجفاف. والغشاء تتحول شفافة ويجب أن لا تتحول مبهمة في أي وقت، وهذا يدل على التجفيف. هل لديك المحقق الثانوي الشروع فورا في تجهيز العينات (القسم 3).
إجراء فحص العين النهائي لضمان سلامة الملتحمة. الاستغناء عن مواد التشحيم العين وإرشاد المشاركينلتجنب فرك عيونهم حتى ترتدي تأثير المخدر قبالة (حوالي 15 دقيقة).

تجهيز 3. عينة

باستخدام المقص الصغير، وقطع الغشاء في نصف (نصف واحد لكل من التحليلات المصب)، عمودي عن طريق الوسط من جمع الخلية. قطع على طول الحافة الخارجية من نصف غشاء لفصلها عن صاحب البلاستيك؛ تجنب التفاعل مع الخلايا التي تم جمعها على الغشاء، بما في ذلك ضمان أن الغشاء لا أضعاف على نفسها.
تأمين غشاء باستخدام الملقط قبل فصل تماما من حامل. مكان الغشاء إلى المسمى أنبوب الطرد المركزي 2 مل تحتوي على 500 ميكرولتر من 95٪ (ت / ت) الإيثانول وتترك لإصلاح مدة لا تقل عن 20 دقيقة إلى حد أقصى قدره 2 ساعة قبل معالجة (القسم 4.2).
الشوط الثاني مستقل على الفور من غشاء (كما هو موضح في القسم 3.2)، والشروع فورا مع القسم 4.1.

تلطيخ 4. عينة

Immunocytochemiكال تلطيخ
1. وضع بعناية غشاء في 35 ملم الزجاج طبق ثقافة القاع مع الجانب جمع لأسفل. ضمان غشاء مسطح.
2. ماصة 20 ميكرولتر من تكوين وصمة عار immunocytochemical تجميعها في القسم 1 إلى الغشاء. إذا عينة تجعيد الشعر يصل، وتستخدم نصائح ماصة المتاح لشد بعناية الغشاء عن طريق دفع أطرافها إلى أسفل. تجنب الاتصال مع المناطق جمع الخلية.
3. تغطية بلطف الغشاء مع غطاء زجاجي زلة. تجنب الحركة غير الضرورية من العينة. تغطية صحن مع غطاء وختم مع مختبر الفيلم حول حواف. لا تعرقل شفافية طبق (العلوي والسفلي)، وتسليط الضوء على عينة. تسمية مع علامة المختبر.
4. الشروع فورا في (القسم 5.1) التصوير، ثم العودة إلى القسم 4.2 على الاستمرار في تلطيخ الخلوي من النصف الآخر من الغشاء.
الخلوي تلطيخ
1. تدريجيا ترطيب الغشاء عن طريق إضافة ببطء 500 ميكرولتر من الماء المقطر إلى أنبوب شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لتثبيت في القسم 3.4. محتويات نضح عدة مرات إلى طرف ماصة إلى المزيج، ثم إزالة المحتويات.
2. إضافة 500 ميكرولتر من الماء المقطر. اسمحوا الوقوف لبضع ثوان، ثم إزالتها. إضافة 500 ميكرولتر من وصمة عار الأزرق الألسيان ويترك لمدة 3 دقائق. إزالة وصمة عار وتنفيذ 3 التوالي 500 ميكرولتر الماء المقطر يشطف أو حتى السائل يشطف واضح.
3. إضافة 500 ميكرولتر من الهيماتوكسيلين # 1 وصمة عار ويترك لمدة 3 دقائق. إزالة وصمة عار وتنفيذ ثلاث 500 ميكرولتر متتالية يشطف بالماء المقطر أو حتى السائل يشطف واضح. يذوى (عكس القسم 4.2.1) بواسطة الشفط السائل واضح.
4. إضافة 500 ميكرولتر من بابانيكولاو OG-6 وصمة عار ويترك لمدة 3 دقائق. إزالة وصمة عار وأداء واحد 500 ميكرولتر 95٪ (ت / ت) شطف الإيثانول.
5. إضافة 500 ميكرولتر من بابانيكولاو EA-65 وصمة عار ويترك لمدة 3 دقائق. إزالة وصمة عار وتنفيذ 3 على التوالي 500 ميكرولتر 95٪ (ت / ت) يشطف الإيثانول.
6. يذوى بشكل كامل باستخدام ثلاث مرات متتالية 500 ميكرولتر 100٪ يشطف الإيثانول. باستخدام TWEezers، وإزالة عينة من الحل. تجنب المناطق جمع خلية مؤثرة.
7. وضع غشاء على شريحة زجاجية. تأكد من أن خط تجميع الخلايا إما موازية أو عمودية على الشريحة هامش لتسهيل التوافق أثناء التصوير.
8. تطبيق قطرة من الإيثانول بنسبة 100٪، وتغطي مع انزلاق زجاج. الشروع فورا في التصوير (القسم 5.2).

التصوير 5. عينة

التصوير نيون Immunocytochemical البقع
1. استخدام متحد البؤر مجهر المسح بالليزر (CLSM) ¹¹ أو مضان المجهر ^12، مزودة بكاميرا رقمية ملونة، وصله بجهاز الكمبيوتر تشغيل برنامج الحصول على الصور. نظرا لعينات يجري الواردة في أطباق الثقافة، قد يكون من الضروري مجهر مقلوب.
2. إعداد المجهر ^11،12 فقا لامتصاص وانبعاث أطياف إيثيديوم homodimer-1 (528/617 نانومتر ماكسيما م ت / م بحضور DNA)، وcalcein AM (494/517 نانومتر Eس / م ماكسيما).
3. تحديد أدنى التكبير المجهر (على سبيل المثال، الهدف 2.5X) وتفعيل نظام التصوير الرقمي. مراقبة العينة المعروضة على شاشة الكمبيوتر.
4. تفقد عينة لميزات الخلوية في المصالح.
5. تحديد المطلوب التكبير المجهر والحصول على الصور باستخدام برامج التصوير.
6. حفظ الملفات في أي شكل ملف المجهر الأصلي أو تنسيق ملف مضغوط (على سبيل المثال، * .raw التي تم *، و tiff).
التصوير الخلوي البقع
1. استخدام المجهر القياسية مختبر مشرق الميدان مع عدم وجود مرشحات، مزودة بكاميرا رقمية ملونة، وصله بجهاز الكمبيوتر تشغيل برنامج الحصول على الصور.
2. مكان وشريحة زجاجية قفل (من الخطوة 4.2.8) على خشبة المسرح المجهر. ترطيب عينة مع الإيثانول بنسبة 100٪ حسب الحاجة، في جميع أنحاء الإجراء التصوير كله.
3. تحديد أدنى التكبير المجهر (على سبيل المثال، الهدف 2.5X) وتفعيل اله نظام التصوير الرقمي. مراقبة العينة المعروضة على شاشة الكمبيوتر.
4. يتم محاذاة ضمان جمع الخلايا إما X أو Y محور السيطرة مرحلة المجهر. ضبط إذا لزم الأمر، عن طريق إزالة الغطاء زلة وتناوب العينة باستخدام طرف ماصة أو ملاقط.
5. باستخدام برامج التصوير، التقاط الصور (ق) من العينة كلها مع أدنى التكبير المجهر.
6. التبديل إلى التكبير المجهر المعتدل (على سبيل المثال، 10 - الهدف 20X) وضبط مصدر ضوء المجهر والمعلمات التصوير البرمجيات (التعرض والتباين وتوازن اللون الأبيض، وما إلى ذلك)، وتعطيل لها القياس برامج الحاسوب الآلي. حفظ هذه الإعدادات لاستخدامها في المستقبل.
7. تحديد بداية ونهاية نقاط فحص (على سبيل المثال، أعلى اليسار واليمنى السفلى من جمع الخلية).
8. باستخدام برامج التصوير، التقاط الصور (ق) في المنطقة بأسرها جمع خلية داخل البداية والنهاية نقطة. ضمان 20٪ جنبا إلى جنب وأعلى إلى أسفل تداخل betwالتابعين كل الصور المجاورة.
9. حفظ الملفات باستخدام تنسيق ملف المجهر الأصلي أو تنسيق ملف مضغوط (على سبيل المثال، * .raw التي تم *، و tiff).
10. توليد صورة بانورامية النهائية باستخدام البرمجيات الآلي خياطة الاختيار (على سبيل المثال، عناصر أدوبي فوتوشوب). استخدام صور المرجعية التي اتخذت في خطوة 5.2.5) لتأكيد دقة خياطة الآلي في الصورة النهائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

غشاء خلية ثقافة امتدت على مدى حامل البلاستيك هو أداة ملائمة لجمع يده من الخلايا الظهارية من الملتحمة غطاء ممسحة. هذا الأسلوب يلغي الحاجة إلى أدوات إضافية معقمة تستخدم عادة لإعداد والتعامل مع الأغشية IC الشكل 1 يصور IC للمنطقة ممسحة غطاء باستخدام إدراج الثقافة الخلية. نحن الأمثل بروتوكولين تلطيخ المختلفة التي تكمل بعضها البعض لتوصيف الخلايا الظهارية من منطقة ممسحة غطاء بطريقة الرواية. الأصباغ immunocytochemical الفلورسنت تكشف النشاط استريز، وهو مؤشر على بقاء الخلية، والأحماض النووية، وتلطيخ الذي يعكس غشاء الخلية وسطا، كما هو مبين في الشكل 2. بروتوكول تلطيخ الخلوي يسمح للتمييز دقيق بين التقرن درجة. ويبين الشكل 3 الانتقال بين التقرن المنخفض في الملتحمة الجفنية والكيراتين المتقدمةسعودة في الملتحمة ممسحة غطاء والبشرة. تصوير بانورامي لمجموعات الخلايا ملطخة الخلايا يسمح تحليل منطقة تجميع كامل، بدلا من منطقة محددة من الفائدة. دقة الصورة كافية للتقريب إلى مستوى النووي؛ مورفولوجيا الخلايا يمكن تحديد بدقة ويبين الشكل 4 الصورة النهائية لمجموعة خلية ملطخة cytologically، مخيط معا باستخدام تقريبا. 100 ملفات منفصلة عالية الدقة. لذا يمكن استخدام هذه الأدوات لتقييم آثار الاحتكاك و / أو جفاف العين بطريقة جديدة.

الشكل 1. الانطباع علم الخلايا من غطاء ممسحة منطقة. علم الخلايا الانطباع أداء في المنطقة غطاء ممسحة كشفها بواسطة انقلاب للخارج من الجفن العلوي. غشاء المستخدمة هي خلية ثقافة إدراج، 12 مم، PTFE ماء. لاحظ علامات التبويب من صاحب الغشاء، والتي يمكن الاحتفاظ بها (على عكس ما قبلدراسات vious على الملتحمة الصلبية، التي تم إزالتها قبل التطبيق) لأنها لا تتداخل مع تطبيق غشاء على هامش الجفن الضيق ويمكن في الواقع مساعدة المحاذاة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. خلايا فلوري من غطاء ممسحة منطقة. يزر متحد البؤر المسح المجهري يظهر الاختلاف من مورفولوجيا الخلايا بين الخلايا الحرشفية كبيرة (أ) وخلايا عمودية / مكعبي الشكل أصغر (ب). مخضر من Calcein AM يشير النشاط استريز في خلايا الجسم (أي بقاء الخلية). مضان أحمر من إيثيديوم يكشف الأحماض النووية، مشيرا إلى حل وسط غشاء الخلية. تظهر خلايا قليلة الأخضر المكثف ولا مضان أحمر، ربما في dicative من سلامة غشاء الخلية (ج). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الخلوي تلون IC عينة. خلايا من الغطاء ممسحة عرض المنطقة التشكل ودرجة التقرن مختلفة متفاوتة. اللون الأزرق من خلايا صغيرة، عمودية ومكعبة مع نواة كبيرة، وجدت في هامشية / الملتحمة الجفنية، يشير لا التقرن (أ)؛ أحمر / برتقالي وصمة عار الخلايا الحرشفية كبيرة مع نواة مكثفة من تقاطع الجلدي الجلدية (الخط المقارن / ماركس) وعديم النواة خلايا البشرة تمثل التقرن المتقدم (ج). اللون الانتقالي (أحمر / أزرق) ومورفولوجيا الخلايا في الغطاء ممسحة منطقة الملتحمة أقترح التقرن محدودة (ب).g3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. صورة مركب من غطاء ممسحة مجموعة الخلية. الانطباع الخلايا من منطقة ممسحة غطاء بعد تلطيخ الخلوي. صورة مخيط معا باستخدام تقريبا. 100 الصور الفردية التي اتخذت مع المجهر والهدف 20X. (أ) عمودي صغير / الخلايا الظهارية مكعبة من عظم الكعب / الملتحمة هامشية. الخلايا هنا يحمل أزرق / أخضر / اللون الأرجواني مما يدل على عدم التقرن. (ب) خلايا الملتحمة غطاء ممسحة، الانتقالية في التشكل واللون وصمة عار بين المناطق (أ) و (ج)؛ (ج) الخلايا الحرشفية كبيرة من مفترق الطرق / خط ماركس الجلدي الجلدية. البرتقال وصمة عار لون يدل على درجة من التقرن، وأحمر / وردي تشير إلى مرحلة متأخرة الانتقال الحرشفية. (د) Meibum الانطباع. (ه) عديم النواة، والخلايا متقرن من البشرة. (و) Gالانطباع خلية oblet أو mucins فيلم المسيل للدموع. السهم نحو الانخفاض يشير منطقة الملتحمة الجفنية، السهم الصاعد يشير الغطاء الخارجي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم تنفيذ الخلايا الانطباع عادة على الملتحمة الصلبية، وذلك باستخدام الأغشية استر السليلوز مختلطة. يتم قطع العينات إلى حجم من صفائح المواد السائبة، تعقيم، تطبيق وإزالتها من على سطح الملتحمة باستخدام ملقط. باستخدام نفس المواد الغشاء، تم تصميم جهاز IC التي تسيطر عليها مكبس مؤخرا لتتناسب مع هندسة سطح الملتحمة الصلبية، والحفاظ على ضغط ثابت بين تطبيقات ^13. هذه الأساليب غير فعالة للضيق، غطاء منحني بارز ممسحة المنطقة (انظر الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، السليلوز مختلطة الأغشية استر لا توفر الشفافية اللازمة للالاجهزة حيث ضروري مشرق المجهري الميدانية حتى تتمشى عينات قبل التصوير الفلورسنت. لإدراج ثقافة خلية المقترحة في هذا البروتوكول أكثر ملاءمة لأنها يتم تعقيم، الحجم مثالي ويمكن التعامل معها يدويا، دون مزيد من المعدات، وضمان مجموعات السريعة. وتصنع أغشية منمحبة للماء PTFE، الذي يوفر الشفافية الكافية لتحليل الفحص المجهري متحد البؤر.

وعموما، الميزات المورفولوجية للخلايا التي تم جمعها تتزامن مع تقارير الأدب السابقة ^{7،8،14،15.} استبدال يشيع استخدامها (ولونيا مكثفة جدا) الدوري حمض شيف (PAS) وصمة عار مع الأزرق الألسيان يسمح الأصباغ بابانيكولاو اللاحقة لعرض تباين لوني أدق، تمكن منظور أكثر تفصيلا على مستوى التقرن الخلوي، من ذكرت من قبل ^7،8.

التصوير المجهري لعينات الخلوي وعادة ما ينطوي الفحص البصري من خلال oculars، والتصوير الفوتوغرافي عالية التكبير من الهياكل تعتبر "المصالح". مع هذا النهج، قد تضيع "الصورة الأكبر" جوانب من جمع كامل. طلقات التكبير المنخفضة وعادة ما تكون من نوعية رديئة البصرية (بسبب التظليل، وانحرافات، وما إلى ذلك) والقرار غير كاف لتصوير التفاصيل الخلويالصورة. اقترح بروتوكول بانورامي خياطة هنا، في حين أن أكثر قليلا تستغرق وقتا طويلا، هو مفيد، حيث أنه يوفر لمحة عامة عن غشاء الكامل، فضلا عن القدرة على تكبير بالتفاصيل النووي، وكلها في صورة واحدة. المقاييس الكمية مثل عدد خلايا نوويا، هيولي (NC) نسبة ¹⁶ والمسافات يمكن حسابها هنا.

هناك ثلاث خطوات حاسمة في إطار البروتوكول التي تتطلب اهتماما خاصا: التطبيق الصحيح للغشاء على الملتحمة (القسم 2.4)، والتوقيت بين خطوات تجهيز العينات (الأقسام 2.6 و 3 إلى 5) والمعلمات التصوير متسقة لخياطة بانورامية المثلى (قسم 5.2 0.6 - 5.2.8). وخلافا للالملتحمة الصلبية مسطحة نسبيا، وغطاء ممسحة المنطقة لديها انحناء وضوحا، والتي تمتد على ضيق عرض فقط 1-2 ملم بين البشرة وتلم الرصغي. ومن الضروري أن يتم تطبيق غشاء على الزاوية الصحيحة، وهذا يمكن أن يؤثر بشكل كبير على نوع من الخلايا التي تم جمعها. ثانيا، ذاكرةيجب أن تكون متسقة بين التطبيقات الضغط الغشاء. ولذلك ينبغي للمحقق تطوير البراعة اللازمة لضمان مجموعات قابلة للتكرار. مرة واحدة يتم جمع العينات باستخدام تقنية الخلايا الانطباع، توقيت المعالجة يصبح حاسما. لا ينبغي أبدا أن يسمح عينات لتجف، أي لا ينبغي أن تصبح الغشاء مبهمة (أقسام 2.6 من 3 إلى 5). بينما العينة على الخضوع لتلطيخ الخلوي يمكن أن تترك في تثبيتي لفترة طويلة من الوقت (20 دقيقة - 2 ساعة)، وينبغي أن يضاف البقع immunocytochemical وتصويرها دون تأخير، لتقييم قابلية الخلية بأكبر قدر ممكن. اتساق توقيت ضروري لنتائج مماثلة بين العينات أيضا. ينبغي للمرء أن نهدف إلى الحفاظ على تحديد وتلطيخ مرات على قدم المساواة لجميع العينات يمكن مقارنتها. وأخيرا، من أجل الحصول على صور بانورامية النوعي للعينة الخلايا، وجميع المعلمات التصوير (المجهر شدة الضوء، والتعرض الكاميرا، وعلى النقيض، توازن اللون الأبيض، وما إلى ذلك)يجب أن تكون محسوبة على منطقة تمثيلية من العينة، وفقا لأعلى تنوع ملامح الفائدة (أي أنواع الخلايا)، وجميع القياس الآلي يتم تعطيل لقطات لاحقة (القسم 5.2.6). يجب على المحقق أن يهدف إلى توجيه جمع خلية في خط إما X أو Y محور المسرح المجهر. وسوف يخفف هذا من الحصول على الصور وعملية خياطة. تهدف إلى تحديد واستخدام ميزات مميزة على عينة (على سبيل المثال، والبقع الخلية، meibum، والحطام، وغيرها) في مناطق تداخل بين الصور المجاورة. ينبغي أن يكون التركيز المجهر التعديل الوحيد الذي يمكن تصحيحه بين الطلقات.

الحد من هذه التقنية تكمن في تنوع مجموعات الخلايا، كما لوحظ في الأصل من قبل جلبير ^8، الذي سجلت نسبة نجاح 67٪ في الحصول على بقع متموجة من الخلايا غطاء ممسحة. زاوية تطبيق تملي على عدد ونوع من الخلايا التي تم جمعها. في هذه المرحلة أنه من غير المؤكد ث جودة جمع hether (أي عدد من الخلايا في العينة) يرتبط ارتباطا مع صحة العين. ضرورية لإثبات صحة هذه التقنية التجارب السريرية مع أحجام أكبر عينة. يوجد أيضا عيب آخر يكمن في غزو يتجزأ من تقنية IC نفسها. تتم إزالة طبقات الخلايا الفائقة بقوة من الملتحمة وهذا ربما تتسبب في ضرر. في حين أن المقصود من البقع immunocytochemical لتعكس بقاء الخلية (والنشاط استريز هي موجودة في جميع المجموعات)، أنه من غير الواضح ما مضان أحمر من نواة الخلية في مجموعاتنا تشير. في بعض الأحيان، meibum (أي الدهون تفرز على حافة الجفن) والمكونات الأخرى من سطح العين أو فيلم المسيل للدموع سوف تميل لتغطية ميزات الخلوية وجعل التحليل صعبا أو مستحيلا. يمكن تعديل بروتوكول مع شطف إضافية في الزيلين لإزالة الدهون meibum. وأخيرا، فإن تأثير قطرات التخدير على الخلايا الملتحمة غير معروف.

> لأن الفحص المجهري متحد البؤر تستغرق وقتا طويلا، وعدد كاف من الصور لا يمكن الحصول عليها عمليا للخياطة بانورامية. تحقيقا لهذه الغاية، يجوز بدلا من ذلك يعملون المجهر epifluorescence منتظم لتقليل وقت التصوير على حساب القرار.

والحصول على بيانات من الهيكل الخلوي في المنطقة غطاء ممسحة مساعدة في التحقق من العلاقة بين الاحتكاك الذي يحدث بين هذه الخلايا وسطح العين، وراحة ذاتية. هذا وسوف توفر معلومات قيمة وتسمح التجارب السريرية في المستقبل لاستكشاف خصوصيات الخلوية من يضعون العدسات اللاصقة، والموضوعات مع epitheliopathy غطاء منديل أو العين أو جفاف الجافة الأعراض، وعلى النقيض من المواد غير متناظرة، لتسليط نأمل الضوء على موضوع عدم الراحة في العين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid	Sigma	B8438-250ML
Hematoxylin, Gill 1	Sigma	GHS116-500ML
Papanicolaou stain, OG-6	Sigma	HT40116-500 ml
Papanicolaou stain, Modified EA	Sigma	HT40232-1L
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit	Life Technologies	L-3224	contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes
Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride)	Alcon
Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	EMD Millipore	PICM01250
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek Corporation	P35G-0-20-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).

Cite this Article

Muntz, A., van Doorn, K.,… More

Muntz, A., van Doorn, K., Subbaraman, L. N., Jones, L. W. Impression Cytology of the Lid Wiper Area. J. Vis. Exp. (114), e54261, doi:10.3791/54261 (2016).

Less

Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions

View Video