ציטולוגיה רושם של פינת מגב ומכסה

Published: August 9, 2016 doi: 10.3791/54261

Alex Muntz¹, Kevin van Doorn¹, Lakshman N. Subbaraman¹, Lyndon W. Jones¹

¹Centre for Contact Lens Research, University of Waterloo

Introduction

העפעף העליון האנושי מבצע כ -10,000 מהבהבת מדי יום ^1, עם רק 1 - באזור לחמית 2 מ"מ צר מנוגדי העולם העיני. בשל התנועה המנגבת שלה במהלך למצמץ, חלק זה של שולי העפעף זכה לכינוי באזור "מגב מכסה" ^2. ההנחה היא כי החיכוך הוא גדל באזור זה במהלך מהבהב הרגיל, בשל המכסה מנגב רחבי הגלובוס. זה עשוי לשחק תפקיד משמעותי בנוחות עינית. עדשות מגע חובשים באי נוחות עינית ניסיון מסוים וזאת אחת הסיבות העיקריות הפסקת עדשה ללבוש ^3. כאשר עדשות מגע מושמות על העין, מקדם החיכוך בין חומר העדשה ואת משטח העין הוכח לשנות ^4. יש ראיות המצביעות על כך סימפטומים יובש יכולים להיות קשורים חיכוך שונה זו ^2,5,6.

קשר זה יכול לבוא לידי ביטוי גם תופעות הנצפה קלינית, wi מכסה בעיקרלכל epitheliopathy (LWE), המכונה גם מכתים שולי העפעף העליון (ULMS) ^6. LWE הוא סימן מוקדם של גירוי של העין מנבא פוטנציאל המחלה עין יבשה. הוא ציין ומדד ידי מכתים החיוניים של אזורים שולי העפעף העליון והתחתון. בעוד לדירוג זה מערכה ² והתוקף הקליני שלה (כלומר, מתאם עם סימפטומים סובייקטיבי) עדיין ניטש ויכוח, אי נוחות עינית נותרת חידה עבור קלינאים ומדענים כאחד, והכי חשוב, מטרד עבור חולים.

עד כה, מעט מאוד ידוע על וריאציות קליניות-רלוונטיות (תת) האנטומיה הסלולר והפיסיולוגיה של אזור מגב המכסה ⁷ ורק אחד דיווחים עושים שימוש בשיטות ציטולוגיה ^8. ציטולוגית Impression (IC) הועסקה במשך 40 שנים כדי לאסוף תאים מפני השטח האפיתל של bulbar או לחמית tarsal ידי יישום של קרום ^9,10. לאחר ההסרה, התאים החסידים לעבור גמכתים ytological והדמיה מיקרוסקופית. בשל ההבדלים אנטומיים הסלולר באזור המגב המכסה, טכניקה זו דורשת אופטימיזציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: לפני איסוף תאים בבני אדם, הודיעה הסכמה ואישור אתיקה יש לקבל.

1. כן Stain

הערה: כן כתם ביום של ניסוי.

הוסף 5 μl Ethidium (או 4 מיקרומטר) ו -5 μl Calcein AM (או 4 מיקרומטר) ל -2.5 מ"ל בופר פוספט (PBS) ב 15 מ"ל צינור צנטריפוגות; לְעַרְבֵּב. עוטפים בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור ולאחסן ב RT עד לשימוש.

2. תאים אסופים

הסר מוסיף תרבית תאים מהאריזה שלהם תווית עבור כל עפעף להיות שנדגמו. מארק הכיוון של אוסף תאים בצד של בעל פלסטיק קרום באמצעות סמן קבע. התנהגות ושספה בדיקה מנורה בהגדלה מתונה (כ 20X) כדי לאשר בריאות הולמת של האזור לעבור IC.
לוותר טיפה אחת של חומר הרדמה (hydrochloride 0.5% proparacaine) שק הלחמית התחתון של eaעין ch ולהורות משתתף לשמור בעיניים עצומות במשך דקה אחת.
אוורט עליון מכסה עין וחזקה במקום על ידי המלקות; להימנע מכל מגע עם אזור מגב מכסה.
אופציונאלי: הסיוע של חוקר משני ייתכן שיידרש לבצע שלב זה.
החל קרום בניצב על החלק המרכזי של אזור מגב המכסה עם לחץ מינימאלי.
החזק קרום במקום במשך 3 - 5 שניות. שים את הממברנה להיות שקוף באזור המגע. בשלב זה, בעדינות להסיר את הקרום ולהתיר את המכסה של המשתתף כדי "להעיף" בחזרה למקומו.
מיד להחיל טיפה אחת של PBS המדגם, כדי למנוע ממנו להתייבש. ממברנה תהפוך שקופה ולא צריך להפוך אטום בכל עת, כמו זו מצביעה על ייבוש. יש החוקר משני להמשיך מיד עם עיבוד של דגימות (סעיף 3).
לנהל בדיקת עיניים סופית כדי להבטיח שלמות של הלחמית. לוותר סיכה עינית ולהורות משתתפיםכדי למנוע שפשוף העיניים שלהם עד מאלחשים פגים (כ. 15 דק ').

עיבוד מדגם 3.

באמצעות מיקרו מספריים, לחתוך את הקרום בחצי (מחצית לכל אחד הניתוחים במורד הזרם), בניצב דרך באמצע אוסף תאים. חותכים לאורך השוליים החיצוניים של חצי קרום אחד להפריד אותו מבעל פלסטיק; למנוע אינטראקציה עם תאים שנאספו על הממברנה, ובכלל זה להבטיח כי הקרום אינו מתקפל על עצמו.
אבטח את הממברנה באמצעות פינצטה לפני ניתוק מן בעל לחלוטין. קרום מקום לתוך צינור צנטריפוגות שכותרתו 2 מ"ל המכיל 500 μl של 95% (V / V) אתנול ולהשאיר לתקן למשך תקופה מינימלית של 20 דקות לכל היותר 2 שעות לפני עיבוד (סעיף 4.2).
מיד נפרד במחצית השנייה של הממברנה (כמתואר בסעיף 3.2) ומיד להמשיך עם סעיף 4.1.

4. לדוגמא מכתימה

Immunocytochemiקאל מכתים
1. בזהירות במקום קרום תרבות צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ עם צד אוסף פונה כלפי מטה; קרום להבטיח שטוח.
2. פיפטה 20 μl של רכב כתם immunocytochemical התאסף בסעיף 1 על הממברנה. אם תלתלים מדגמים, משתמשים טיפי פיפטה חד פעמיים כדי לשטח את הקרום בקפידה על ידי לדחוף למטה הקצוות שלה. יש להימנע ממגע עם אזורי אוסף תאים.
3. בעדינות לכסות את הממברנה עם תלוש כיסוי זכוכית. הימנע תנועה של מדגם מיותרת. מכסים בצלחת עם מכסה לאטום עם סרט מעבדה מסביב לקצוות. אין לחסום את השקיפות של צלחת (עליון ותחתון) ו נראה של מדגם. לייבל בטוש במעבדה.
4. מייד להמשיך עם הדמיה (סעיף 5.1), ואז לחזור סעיף 4.2 להמשיך עם מכתים ציטולוגיה של החצי השני של הממברנה.
ציטולוגית מכתים
1. בהדרגה מימה קרום ידי הוספת לאט 500 μl של מים מזוקקים אל הצינור used עבור קיבעון בסעיף 3.4. תוכן לשאוב כמה פעמים לתוך קצה פיפטה לערבב, ולאחר מכן להסיר תוכן.
2. הוסף 500 μl של מים מזוקקים. ולתת לעמוד במשך כמה שניות, ולאחר מכן להסיר. הוסף 500 μl של כתם Alcian כחול ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע 3 ברציפות 500 μl מים מזוקקים מי שטיפת או עד שהנוזלים בשטיפות ברור.
3. הוסף 500 μl של כתם Hematoxylin # 1 ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע שלושה רצופים 500 μl שטיפות מים מזוקקים או עד שהנוזלים בשטיפות ברור. מייבשים (הפוך סעיף 4.2.1) על ידי aspirating הנוזל השקוף.
4. הוסף 500 μl של Papanicolaou OG-6 הכתם ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע אחד 500 μl 95% (v / v) שטיפה אתנול.
5. הוסף 500 μl של Papanicolaou EA-65 הכתם ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע 3 ברציפות 500 μl 95% (V / V) אתנול שטיפות.
6. לגמרי מייבשים באמצעות שלושה רצופים 500 μl 100% שטיפות אתנול. שימוש tweezers, להסיר מדגם מפתרון; להימנע מאזורי אוסף תא נוגעים ללב.
7. מקום קרום בשקופית זכוכית; אוסף להבטיח התא כי הקו הוא גם במקביל או בניצב להחליק שולי עבור יישור קל במהלך ההדמיה.
8. החל ירידה של אתנול 100% ומכסים להחליק זכוכית. מיד להמשיך עם הדמיה (סעיף 5.2).

הדמיה מדגם 5.

כתמי הדמית פלורסנט Immunocytochemical
1. שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM) ¹¹ או הקרינה מיקרוסקופ ^12, מצויד במצלמת צבע דיגיטלית, מחובר למחשב מפעיל תוכנת רכישת התמונה. בשל הדגימות להיות כלול בתוך תרבות מנות, מיקרוסקופ הפוכה עשויה להיות נחוצה.
2. הגדרת מיקרוסקופ ^11,12 פי ספקטרום בליעה ופליטה של 1 homodimer ethidium (528/617 מקסימום Ex / Em ננומטר בנוכחות דנ"א) calcein AM (494/517 E ננומטרx / Em מקסימום).
3. בחר את ההגדלה הנמוכה ביותר של מיקרוסקופ (למשל, המטרה פי 2.5) ולהפעיל את מערכת ההדמיה הדיגיטלית; להתבונן המדגם המוצג על צג המחשב.
4. בדוק מדגם עבור תכונות הסלולר של עניין.
5. בחר הגדלה במיקרוסקופ רצוי לרכוש תמונות באמצעות תוכנת הדמיה.
6. שמור קבצים או בפורמט מיקרוסקופ קובץ מקורה או פורמט קובץ דחוס (לדוגמא: * .raw, * .tiff).
כתמי הדמית ציטולוגיה
1. שימוש במיקרוסקופ שדה בהיר מעבדה סטנדרטי ללא מסננים, מצויד במצלמת צבע דיגיטלית, מחובר למחשב מפעיל תוכנת רכישת תמונה.
2. מקום וחלק זכוכית מנעול (משלב 4.2.8) על במת מיקרוסקופ. רעננותם המדגם עם 100% אתנול לפי הצורך, לאורך כל ההליך הדמיה כולו.
3. בחר את ההגדלה הנמוכה ביותר של מיקרוסקופ (למשל, המטרה פי 2.5) ולהפעיל המערכת הדמיה דיגיטלית דואר; להתבונן המדגם המוצג על צג המחשב.
4. ודא אוסף תא מיושר עם או X או Y ציר שליטה הבמה מיקרוסקופ. התאם במידת הצורך, על ידי הסרת להחליק את המכסה וסיבוב המדגם באמצעות קצה פיפטה או פינצטה.
5. באמצעות תוכנת הדמיה, לכידת תמונה (ים) מכלל המדגם עם ההגדלה במיקרוסקופ הנמוך ביותר.
6. Switch to ההגדלה במיקרוסקופ מתונה (למשל, 10 - 20X אובייקטיבי) ולהתאים מקור אור מיקרוסקופ ופרמטרי הדמית תוכנה (חשיפה, ניגודיות, איזון לבן, וכו '), ולהשבית המדידה האוטומטית התוכנה שלהם. שמור הגדרות אלה לשימוש עתידי.
7. לקבוע נקודות התחלה וסיום של סריקה (למשל, בפינה השמאלית עליונה ופינות ימניות תחתונות של אוסף תאים).
8. באמצעות תוכנת הדמיה, לכידת תמונה (ים) של האזור אוסף התא כולו בתוך נקודות התחלה וסיום. הבטח 20% מצד אל צד מלמעלה כלפי מטה לפי חפיפה between כל התמונות הסמוכות.
9. שמור קבצים באמצעות פורמט קובץ מיקרוסקופ יליד או פורמט קובץ דחוס (לדוגמה: * .raw, * .tiff).
10. צור תמונת פנורמית סופית באמצעות תוכנת חיבור אוטומטית של בחירה (למשל, Adobe Photoshop אלמנטים). השתמש בתמונות התייחסות נלקחו ב שלב 5.2.5) כדי לאשר את הדיוק של התפרים האוטומטיים בתמונה הסופית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קרום תרבית תאים, השתרע על בעל הפלסטיק הוא כלי נוח לאיסוף כף יד של תאי אפיתל מן לחמית מגב מכסה. שיטה זו מבטלת את הצורך מכשירים מעוקרים נוספים המשמשים בדרך כלל להכין ולטפל ממברנות IC. איור 1 מתאר את IC של האזור מגב המכסה באמצעות להכניס תרבית תאים. אנו אופטימיזציה שני פרוטוקולים מכתימים שונים המשלימים זה את זה כדי לאפיין תאי אפיתל מאזור מגב המכסה באופן רומן. צבעי immunocytochemical פלורסנט לחשוף פעילות אסטראז, אינדיקטור של כדאיות התא, וחומצות גרעין, מכתים של המשקף פשרה קרום התא, כפי שמוצג באיור 2. פרוטוקול מכתים ציטולוגית מאפשר הבחנה דקה בין קרטיניזציה מעלות. איור 3 מציג את המעבר בין קרטיניזציה הנמוכה בלחמית tarsal קרטין המתקדמתization בלחמית מגב המכסה האפידרמיס. הדמיה פנורמי של אוספי תא מוכתם ציטולוגיה מתירה ניתוח באזור האוסף כולו, להבדיל אזור של עניין שנבחר. רזולוציית תמונה היא נאותה עבור התקרבות לרמה גרעינית; מורפולוגיה תאים ניתן לקבוע בדייקנות. איור 4 מראה את התמונה הסופית של אוסף תא מוכתם cytologically, מאוחה באמצעות כ. 100 קבצים ברזולוציה גבוהה נפרדים. כלים אלה יוכלו להיות מועסקים על מנת להעריך את ההשפעות של חיכוך ו / או יובש בעיניים בצורת רומן.

ציטולוגית Impression באיור 1. של מכסת מגב פינה. ציטולוגית Impression מבוצעת על אזור מגב מכסה החשוף ידי eversion של העפעף העליון. ממברנה בשימוש הוא תא תרבות הכנס, 12 מ"מ, PTFE הידרופילי. הערת הכרטיסיות של בעל הקרום, אשר ייתפס (בניגוד מראשמחקרים vious על הלחמית bulbar, שבו הם הוסרו לפני היישום) כפי שהם אינם מפריעים היישום של הממברנה על שולי העפעף צרים עשויים לסייע יישור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. תאי פלורסנט ממכסה מגב האזור. מיקרוסקופיית ליזר Confocal מראים וריאציה של מורפולוגיה תאים בין תאי קשקש הגדולים (א) ותאי cuboidal העמודים / הקטנים (ב). פלואורסצנטי ירוק של Calcein AM מראה על פעילות אסטראז בגוף התא (כלומר, כדאיות התא). קרינה אדומה של Ethidium מגלה חומצות גרעין, המציין פשרת קרום תא. תאי מעטי מראים ירוקים אינטנסיבי ולא קרינה אדומה, אולי dicative של שלמות קרום התא (ג). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. ציטולוגית הכתמה של מדגם IC. תאים של המופע באזור מגב מכסה השונה מורפולוגיה מעלה קרטיניזציה שונה. צבע הכחול של תאים קטנים, כמו עמודים cuboidal עם גרעינים גדולים, נמצאים הלחמית השולית / tarsal, מציין שאין קרטיניזציה (א); כתם אדום / כתום של תאי קשקש גדולים עם גרעינים תמציתיים של צומת muco-עורית (MCJ / הקו 'מרקס) ו anuclear תאים של האפידרמיס ייצג קרטיניזציה מתקדם (ג). צבע מעבר (אדום / כחול) ומורפולוגיה של תאים באזור הלחמית מגב המכסה מציעים מוגבלת קרטיניזציה (ב).g3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. תמונה מורכבת של לוד מגב Cell אוסף. ציטולוגית הופעות של אזור מגב המכסה לאחר מכתים ציטולוגיה. תמונה מאוחית באמצעות כ. 100 תמונות בודדות שצולמו באמצעות מיקרוסקופ ואובייקטיבי 20X. (א) עמודים קטנים / תאי אפיתל cuboidal של הלחמית tarsal / השולית. תאים כאן מפגינים כחול / ירוק / צבע סגול המציין אין קרטיניזציה; (ב) תאים של הלחמית מגב המכסה, מעבר במורפולוגיה וצבע הכתם בין אזורים (א) ו- (ג); (ג) תאים קשקשיים גדול של צומת muco-עורית / 'קו מרקס. צבע כתם כתום עולה רמה מסוימת של קרטיניזציה, ואדום / ורוד מצביע בשלב מאוחר מעבר קשקש; (ד) רושם מייבום; (ה) anuclear, תאי cornified של האפידרמיס; (ו) Gרושם תא oblet או מוקיוס שכבת דמעות. חץ כלפי מטה מציין אזור הלחמית tarsal, חץ כלפי מעלה מצביע על מכסה חיצוני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ציטולוגיה רושמת בדרך כלל מבוצעת על הלחמית bulbar, באמצעות ממברנות אסתר תאיות מעורב. דוגמאות נחתכים לגודל מסדינים חומר בתפזורת, מעוקר, שיושמה להסיר מפני השטח של הלחמית באמצעות מלקחיים. כל שימוש אחר בחומר קרום אותו, מכשיר IC-נשלט בוכנה נועד לאחרונה כדי להתאים את הגיאומטריה השטח של לחמית bulbar, ולשמור לחץ עקבי בין יישומים ^13. גישות אלה אינן יעילות עבור המכסה הצר, מפותל באופן בולט מגב באזור (ראה איור 1). בנוסף, ממברנות אסתר התאיות מעורב אינן מספקות את השקיפות הנדרשת עבור setups שבו מיקרוסקופ שדה הבהיר יש צורך ליישר דגימות לפני הדמית ניאון. מוסיף תרבית התאים הציעו בפרוטוקול זה נוח כי הם מעוקרים, אידיאליים בגודל יכולים להיות מטופלים באופן ידני, ללא ציוד נוסף, הבטחת אוספים מהירים. ממברנות עשויותהידרופילי PTFE, המספק שקיפות נאותה לניתוח מיקרוסקופיה confocal.

בסך הכל, תכונות מורפולוגיות של תאים שנאספו לחפוף עם דיווחים בספרות קודמים ^7,8,14,15. החלפת נפוץ (ו chromatically מאוד אינטנסיבי) תקופתיים חומצה שיף (PAS) הכתם עם כחול alcian מאפשר צבעי Papanicolaou לאחר להציג וריאציה כרומטית עדין, המאפשר מבט מפורט יותר על רמת קרטיניזציה הסלולר, מכפי שדווח לפני ^7,8.

הדמיה מיקרוסקופית של דגימות ציטולוגית בדרך כלל בדיקה ויזואלית דרך oculars, וצילום והגברה גדולה של מבנים ייחשבו "עניין". עם גישה זו, "תמונה גדולה" היבטים של האוסף כולו עלולים ללכת לאיבוד. יריות בהגדלה נמוכות הן בדרך כלל באיכות אופטית נחותה (בשל vignetting, סטיות, וכו ') וההחלטה אינה מספיקה כדי לתאר פרט הסלולרים. פרוטוקול התפרים פנורמי המוצע כאן, בעוד מעט יותר זמן רב, הוא בעל יתרונות רב, כפי שהוא מספק סקירה של קרום המלא, כמו גם את היכולת להתמקד ב לפרטים גרעיניים, כל בתמונה אחת. מדדים כמותיים כגון ספירת תאי, גרעיני cytoplasmic (NC) יחס ¹⁶ ומרחקים ניתן לחשב כאן.

ישנם שלושה שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול מחייבות התייחסות מיוחדת: יישום נכון של הקרום על הלחמית (סעיף 2.4), עיתוי בין מדרגות עיבוד המדגם (סעיפים 2.6 ו -3 עד 5) ופרמטרי הדמיה עקביים ספרוני פנורמי אופטימליים (סעיף 5.2 .6 - 5.2.8). בניגוד הלחמית bulbar השטוחה יחסית, המכסה מגב באזור יש עקמומיות מובהקות, פורש ברוחב צר של רק 1 - 2 מ"מ בין האפידרמיס מענית tarsal. זה חיוני כי הממברנה להיות מיושם בזווית הנכונה, כמו זה יכול מאוד להשפיע על סוג של תאים שנאספו. שנית, מלחץ טאי טען כי צריך להיות עקבי בין יישומים. החוקר ולכן צריך לפתח את הכשרון ההכרחי להבטחת אוספי דיר. לאחר הדגימות נאספות באמצעות טכניקת הציטולוגיה הרושמת, התזמון של עיבוד הופך להיות קריטי. אף פעם לא צריכים להיות מותרות דוגמאות להתייבש, כלומר, הממברנה לא צריכה להיות אטומים (סעיפים 2.6, 3 עד 5). אמנם המדגם לעבור מכתים ציטולוגית ניתן להשאיר מקבע במשך זמן ממושך (20 דק '- 2 שעות), הכתמים immunocytochemical יש להוסיף צילמו ללא דיחוי, על מנת להעריך את כדאיות התא בצורה מדויקת ככל האפשר. עקביות של עיתוי חיונית גם תוצאות דומות בין דגימות; אחד צריך לשאוף לשמור פעמי תיקון ו מכתים שווה לכל דגימות השוואה לשנים קודמות. לבסוף, על מנת לקבל תמונות פנורמיות איכותיות של מדגם הציטולוגיה, כל פרמטרי ההדמיה (עוצמת אור מיקרוסקופ, חשיפת מצלמה, ניגודיות, איזון לבן, וכו ')יש לכייל לאזור נציג של המדגם, עם המגוון ביותר של תכונות של עניין (כלומר, סוגי תאים), וכל המדידה האוטומטית יושבת יריות עוקבות (סעיף 5.2.6). החוקר צריך גם לכוון להתמצא באוסף תא בקנה אחד עם X או ציר Y של הבמה מיקרוסקופ. זה יקל על רכישת התמונה תהליך התפירה. כוון לאתר ולהשתמש מאפיינים בולטים על המדגם (למשל, תיקוני תא מייבום, פסולת וכו ') באזורים החופפים בין תמונות סמוכות. מוקד מיקרוסקופ צריך להיות ההתאמה רק כדי להיות מתוקן בין יריות.

המגבלה של שיטה זו טמונה ההשתנות של אוספי תא, כפי שנצפה במקור על ידי Jalbert ^8, אשר דיווח על שיעור הצלחה 67% בהשגת טלאים ומחוברים של תאי מגב מכסה. זווית היישום מכתיבה את המספר וסוג התאים שנאספו. בשלב זה אין כל ודאות w איכות אוסף הקביעה האם (כלומר, מספר התאים על המדגם) מתואם עם בריאות העין. ניסויים קליניים עם גודל מדגם גדול יותר נחוצים כדי להוכיח את אמינותה של טכניקה זו. חסרון נוסף נעוצת הפולשנות הטבועה של טכניקת IC עצמו. שכבות התא מעולה יוסרו בכוח מביתו לחמית והדבר עלול לגרום נזק. בעוד כתמי immunocytochemical נועדו לשקף כדאיויות תא (ופעילות אסטראז נוכח בכל האוספים), לא ברור מה הקרינה האדומה של גרעיני תאים באוספים שלנו מצביעה. לפעמים מייבום (כלומר, שומנים המופרשים על שולי העפעף) ורכיבים אחרים מפני השטח של העין או שכבת הדמעות יטו לכסות תכונות הסלולר ולעשות ניתוח קשה או בלתי אפשרי. הפרוטוקול יכול להיות שונה עם שטיפה נוספת קסילן להסרת שומנים מייבום. לבסוף, ההשפעה של טיפות הרדמה על תאי הלחמית אינה ידועה.

> מכיוון מיקרוסקופיה confocal הוא גוזל זמן מספר מספיק של תמונות שאינו בר השגה כמעט ספרוני פנורמי. לשם כך, מיקרוסקופיה epifluorescence הרגילה יכולה במקום להיות מועסקת על מנת לקצר את זמן הדמיה על חשבון רזולוציה.

קבלת נתונים של המבנה התאי של אזור מגב המכסה תעזור לאמת את המתאם בין החיכוך המתרחש בין תאים אלה ועל פני השטח של העין, ונוחות סובייקטיבי. זה יספק ידע יקר ערך ולאפשר ניסויים קליניים בעתיד כדי לחקור את הייחוד הסלולר של למרכיבי עדשות מגע, נבדק עם epitheliopathy מגב מכסה, תסמיני עין או יובש יבשים, בניגוד לנושאי אסימפטומטית, בתקווה לשפוך אור על הנושא של אי נוחות עינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid	Sigma	B8438-250ML
Hematoxylin, Gill 1	Sigma	GHS116-500ML
Papanicolaou stain, OG-6	Sigma	HT40116-500 ml
Papanicolaou stain, Modified EA	Sigma	HT40232-1L
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit	Life Technologies	L-3224	contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes
Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride)	Alcon
Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	EMD Millipore	PICM01250
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek Corporation	P35G-0-20-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).

Cite this Article

Muntz, A., van Doorn, K.,… More

Muntz, A., van Doorn, K., Subbaraman, L. N., Jones, L. W. Impression Cytology of the Lid Wiper Area. J. Vis. Exp. (114), e54261, doi:10.3791/54261 (2016).

Less

Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions

View Video