Summary
We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.
Abstract
Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.
Introduction
Den menneskelige øvre øyelokk utfører rundt 10.000 blinker hver dag en, med bare en 1 – 2 mm smal konjunktival region motstrid okulær kloden. På grunn av sin tørke bevegelse under blink, har denne del av lokket margin blitt kalt "lokket vindusvisker" region 2. Det antas at friksjonen økes i dette område i løpet av sedvanlig blinkingen, på grunn av lokket tørke over hele kloden. Dette kan spille en betydelig rolle i okulær komfort. Kontaktlinsebrukere særlig erfaring ubehag i øyet, og dette er en av de viktigste årsakene til å slutte linse slitasje tre. Når en kontaktlinse er plassert på øyet, er friksjonskoeffisienten mellom linsematerialet og den okulære overflate vist seg å endre 4. Det er bevis som tyder på at tørrhetssymptomer kan være relatert til dette endret friksjon 2,5,6.
Denne foreningen kan også gjenspeiles i klinisk observerbare fenomener, spesielt lokk wiper epitheliopathy (LWE), også kalt øvre øyelokk margin farging (ULMS) 6. LWE er et tidlig tegn på okulær irritasjon og en potensiell prediktor for sykdommen tørre øyne. Det er observert og målt ved den vitale farging av de øvre og nedre lokk margin regioner. Selv om dette karakterskala to og klinisk validitet (dvs. sammenheng med subjektive symptomer) er fortsatt under debatt, ubehag i øyet er fortsatt en gåte for klinikere og forskere både og, viktigst, en ulempe for pasientene.
To-date, er lite kjent om klinisk relevante variasjoner i (sub-) cellulære anatomi og fysiologi av lokket visker området 7 og bare en rapport gjør bruk av cytologiske metoder 8. Impression cytologi (IC) har vært ansatt i over 40 år å samle celler fra epithelial overflaten av slagflaten eller tarsal conjunctiva ved anvendelse av en membran 9,10. Ved fjerning de adherente celler gjennomgår cytological farging og mikroskopisk bildebehandling. På grunn av de anatomiske og cellulære forskjeller i lokket visker region, krever denne teknikk optimalisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Impression cytologi er vanligvis utføres på slagflaten konjunktiva, ved hjelp av blandet celluloseestermembraner. Prøver som er kuttet til riktig størrelse fra massegods ark, sterilisert, brukes og fjernes fra bindehinneoverflaten ved hjelp av tang. Ved bruk av samme membranmaterialet, ble en stempelstyrt IC-enheten nylig er utformet for å samsvare med overflaten geometrien til slagflaten conjunctiva, og opprettholde konsistente trykk mellom programmer 13. Disse metodene er ineffektive for den smale, fre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge our colleague Dr. Jalaiah Varikooty who provided insight and expertise on the topic of the lid wiper, that greatly assisted this research.
Materials
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx’s line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. . Confocal microscopy. , 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
