Os ensaios para a degradação de proteínas em células deformadas
Summary
This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.
Abstract
Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.
Introduction
As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células, e que desempenham um papel essencial em praticamente todos os processos biológicos. A actividade biológica da maioria das proteínas requer a sua dobragem em, e manter, as estruturas tridimensionais nativas. Proteínas com conformações aberrantes não só perder as suas funções normais, mas também frequentemente formar espécies oligoméricas solúveis ou agregados que prejudicam as funções de outras proteínas e que são tóxicos para as células 1,2. Para contrariar misfolding proteína, as células empregam ambos os chaperones moleculares, que ajudam polipeptídeos desdobradas ou parcialmente dobradas para chegar a sua conformação nativa e vias de degradação, o que elimina proteínas deformadas 3. Dada a complexidade e natureza estocástica do processo de dobramento, proteína misfolding é inevitável, e não pode ser revertida no caso de mutações, erros biossintéticos, e danos pós-traducionais 1. Assim, em última análise, as células dependem de degradatvias de íons para manter a sua qualidade de proteína.
A importância do controlo de qualidade de proteínas celulares (PQC) sistemas é sublinhada pela prevalência de doenças misfolding de proteínas, incluindo cancro, diabetes, e várias doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington (HD), e ataxias espinocerebelares (SCA) 4,5. Por exemplo, as mutações no gene supressor tumoral p53 é a única lesão genética mais frequentemente em tumores, associada a ~ 50-70% de todos os casos 6. Uma fração substancial das mutações de p53 são Mutações que alteram a conformação da p53, levando à formação de agregados 7. Além disso, proteínas com trechos poliQ expandidas são geneticamente e patologicamente associado com HD e SCA. Estas doenças progressivas e muitas vezes fatais manifesta quando o comprimento do troço poliQ nas proteínas afectados excede um determinado thressegurar, e torna-se cada vez mais grave quanto o comprimento do troço poliQ prolonga 8.
Uma abordagem atraente para o tratamento destas doenças é reforçar terapeuticamente sistemas PQC celulares, especialmente as vias de degradação. No entanto, as vias envolvidas na degradação de proteínas defeituosas, particularmente aqueles em células de mamíferos, permanecem pouco compreendidos. Apesar de ter sido reconhecido que o proteassoma é criticamente importante para a degradação de proteínas deformadas, um problema fundamental permanece indefinido: como proteínas deformadas são especificamente reconhecidos e direccionado para a degradação. Além disso, embora os sistemas de PQC foram identificados em compartimentos celulares, incluindo o citoplasma, retículo endoplasmático, e a mitocôndria, os sistemas de PQC no núcleo permanecem obscuros 2.
Estudos recentes do nosso laboratório identificaram um sistema que reconhece e degrada a uma variedade de proteínas mal enroladas no núcleocélulas de mamíferos 9. Este sistema é constituído por a proteína promielocítica (PML), uma proteína nuclear e um membro da família de proteínas contendo o motivo tripartida (TRIM), e RNF4, um anel-domínio contendo proteína. PML, e várias outras proteínas guarnição, possuem SUMO (pequeno modificador ubiquitina-like) atividade ligase E3, o que facilita a especificidade e eficiência de SUMOilação proteína 10. RNF4 pertence a um pequeno grupo de ubiquitina ligases-alvo SUMO (Stubl), que contêm um ou mais motivos interactuantes de sumo (SIMs), para além do domínio RING que lhes proporciona a actividade de ubiquitina-ligase 11. Descobrimos que PML reconhece especificamente proteínas deformadas através de sites de reconhecimento do substrato discretos que podem discernir características distintas em proteínas deformadas. Após a ligação, as etiquetas PML misfolded proteínas com poli-cadeias de SUMO2 / 3, duas proteínas de mamífero SUMO praticamente idênticos que podem formar poli-cadeias, devido à existência de um local de SUMOilação interna. Sproteínas deformadas UMOylated são depois reconhecidos por RNF4, o que leva a sua degradação e ubiquitinação proteossoma. Demonstramos ainda que o sistema de PML-RNF4 é importante para a protecção contra a neurodegeneração, como deficiência de PML exacerba os defeitos comportamentais e neuropatológicas de um modelo de rato do tipo 1 SCA (SCA1) 9.
Para distinguir a degradação da proteína a partir de outros mecanismos celulares que podem regular os níveis de proteína, as taxas de turnover de proteína foi medida 9. Entre os métodos mais frequentemente utilizados para determinar o volume de negócios proteínas são perseguição de pulso e cicloheximida (CHX) perseguição. Estes dois métodos examinar ao longo do tempo, respectivamente, as proteínas marcadas com radioisótopos de interesse em células-tradução eficiente e proteínas totais preexistentes de interesse em células-tradução inibido. No entanto, um grande desafio para o estudo de proteínas patogénicas e enrolamento incorrecto propensa é que a semi-vida dessas proteínas podem ser extremamente eisng. Por exemplo, Ataxina-1, Ataxina-7, Huntingtina, α-sinucleína, e TDP-43 têm meias-vidas de mais de 12 a 24 horas 9,12-16. As taxas de rotação lenta destas proteínas impede o uso da análise CHX perseguição, porque as células que albergam estas proteínas não podem sobreviver inibição de tradução prolongada, especialmente porque as proteínas mal enroladas podem eles mesmos serem altamente tóxicas para as células. A análise pulse-chase com marcação isotópica também pode ser um desafio para as proteínas que são altamente agregação-prone. A maioria dos ensaios de pulse-chase confiar em imunoprecipitação para separar a proteína de interesse a partir de todas as outras proteínas que também são marcados radioactivamente. Este procedimento normalmente inclui imunoprecipitação e lavagem de procedimentos morosos, durante os quais os agregados SDS-insolúveis podem formar, fazer a análise com eletroforese SDS-PAGE impreciso.
Aqui um protocolo para analisar proteínas deformadas nucleares com uma taxa de rotatividade lenta é descrito 9. A forma patogénica da Ataxina-1 (Atxn1) que contém um trecho de 82 glutaminas (Atxn1 82Q) é usado para este propósito 8. Quando expresso em células, uma proteína fluorescente (GFP) de fusão de verde melhorada Atxn1 82Q formas microscopicamente inclusões visíveis no núcleo (Figura 1A). Análise de pesquisa por pulso revela que a meia-vida de Ataxn1 82Q é mais de 18 horas 9. Atxn1 82Q é composto por espécies com conformações mal dobradas de características diferentes, bem como espécies com conformação nativa. É provável que estas espécies são degradadas a velocidades diferentes e, assim, devem ser analisados separadamente. Os lisados de Atxn1-82Q-GFP expressando células são fraccionados em NP-40-solúvel (solúveis ou NS, provavelmente representando proteínas nativas ou proteínas monoméricas / oligomérico misfolded) e (NI, agregado / misfolded) porções de NP-40 insolúvel. Este último pode ser dividido em SDS-solúvel (SS; prováveis agregados desordenadas) ou SDS-resistente (SR; fibrilas amilóides prováveisFracções) (Figura 1B). fracções NS e SS pode ser analisada por SDS-PAGE seguida por transferência de Western, enquanto que a fracção SR pode ser detectada por ensaios de retardamento do filtro, seguido de imunotransf erência. CHX perseguição é combinada com o método de fraccionamento de detergente, e descobriram que a sua meia-vida de SS Atxn1 82Q é muito mais curto do que o de NS Atxn1 82Q total e Atxn1 82Q (Figura 2A), indicando que a fracção SS pode ser facilmente reconhecido e degradado nas células 9. Assim, este método proporciona uma poderosa ferramenta para estudar a dinâmica das proteínas deformadas e para comparar o seu padrão de degradação.
Também descrevemos um método que é adequado para o rastreio de elevado rendimento para identificar pequenas macromoléculas ou compostos que podem modular a degradação de proteínas mal enroladas. Este método baseia-se um mutante conformacionalmente desestabilizado de luciferase de pirilampo (LucDM) 17, um substrato modelo de chaperona. Temos fusíveld LucDM para um sinal de localização nuclear (NLS) para sondar os sistemas PQC neste compartimento celular, e GFP (NLS-GFP-LucDM) para facilidade de detecção. Formas NLS-LucDM-GFP microscopicamente agregados nucleares visíveis em uma pequena porcentagem de células (Figura 3A). Semelhante a Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP, mas não o seu tipo selvagem homólogo NLS-LucWT-GFP-se modificado por SUMO2 / 3 e regulamentada pela via PML-RNF4 9. -NLS-GFP LucDM também forma SS e SR espécies, embora as quantidades relativas de SS e SR espécies são mínimas em relação ao NS, utilizando as condições descritas no Protocolo 3 abaixo. Para simplificar o ensaio, só analisar SDS LucDM solúveis (incluindo ambas as fracções NS e SS) através de SDS-PAGE e Western blot. Importante, ensaio de perseguição CHX mostraram que a semi-vida de SDS-solúvel NLS-LucDM-GFP é muito mais curto do que o do seu tipo selvagem correspondente (Figura 3B), sugerindo que LucDM é um substrato específico para o sistema que reconhece e se degradaproteínas deformadas.
A degradação de LucDM-GFP provoca uma queda significativa em geral do sinal de fluorescência. Assim, desenvolvemos também um protocolo para a detecção em tempo real de LucDM-GFP celular utilizando um ensaio baseado em fluorescência de microplacas. Muitos sistemas de tela de alto rendimento (HTS) são desenvolvidos para drogas ou genes modificadores agregados celulares e viabilidade celular causadas por proteínas aberrantes 18-20. No entanto, muito poucas HTSS são especificamente concebidos para direccionar a degradação em células de mamífero. Este protocolo serve como um sistema robusto para a análise de grande escala rápida e de os efeitos da expressão da proteína, knockdown, e tratamento com drogas sobre a degradação da proteína com enrolamento incorrecto celular. Usando células HeLa como exemplo, a seguir descrevem-se os protocolos para a análise das duas proteínas mal enroladas. Os ensaios também podem ser aplicados a outras linhas de células, embora as condições de transfecção e decurso de tempo pode necessitar de ser optimizado para as linhas de células individuais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os mecanismos que regulam a degradação de proteínas mal dobradas são essenciais para a manutenção da homeostase de proteínas celulares, e que provavelmente representam alvos de medicamentos valiosos para o tratamento de doenças neurodegenerativas e outras doenças misfolding-proteína. Aqui, os ensaios que examinam a degradação de proteínas mal dobradas são descritos, utilizando uma proteína patogénica Atxn1 (Atxn1 82Q) e um mutante nuclear localizada luciferase (NLS-LucDM) como exemplos.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
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