Saggi per la degradazione delle proteine nelle cellule mal ripiegate
Summary
This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.
Abstract
Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.
Introduction
Le proteine sono macromolecole più abbondanti nelle cellule, e svolgono un ruolo essenziale in quasi tutti i processi biologici. L'attività biologica della maggior parte delle proteine richiede la loro piegatura in, e mantenendo, i nativi strutture tridimensionali. Proteine con conformazioni aberranti non solo perdono le loro normali funzioni, ma anche spesso formano specie oligomeriche solubili o aggregati che compromettono le funzioni di altre proteine e sono tossici per le cellule 1,2. Per contrastare misfolding, le cellule utilizzano entrambe le chaperon molecolari, che assistono polipeptidi non piegati o parzialmente piegati per raggiungere la loro conformazione nativa, e vie di degradazione, che eliminano le proteine mal ripiegate 3. Data la complessità e la natura stocastica del processo di piegatura, proteine misfolding è inevitabile, e non può essere invertito nel caso di mutazioni, errori biosintetici e danni post-traduzionali 1. Quindi, in ultima analisi, le cellule si basano su degradatpercorsi di ioni per mantenere la qualità delle proteine.
L'importanza del controllo della qualità delle proteine cellulari (PQC) sistemi è sottolineata dalla prevalenza di malattie proteine misfolding, tra cui il cancro, il diabete, e molte malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Huntington (HD), e atassie spinocerebellari (SCA) 4,5. Ad esempio, le mutazioni nel p53 soppressore del tumore è la singola lesione più frequentemente genetico nei tumori, associata a ~ 50-70% di tutti i casi 6. Una frazione sostanziale di p53 mutazioni sono mutazioni missenso che alterano la conformazione di p53, che porta alla formazione di aggregati 7. Inoltre, le proteine con tratti polyQ espanse sono geneticamente e patologicamente associati con HD e SCA. Queste malattie progressive e spesso fatali manifesta quando la lunghezza del tratto polyQ nelle proteine coinvolte supera un certo THREStenere, e diventa sempre più gravi come la lunghezza del tratto polyQ prolunga 8.
Un approccio interessante per il trattamento di queste malattie è quello di rafforzare i sistemi terapeuticamente PQC cellulari, in particolare le vie di degradazione. Tuttavia, i meccanismi coinvolti nella degradazione delle proteine difettose, in particolare quelli in cellule di mammifero, rimangono poco conosciuti. Anche se è stato riconosciuto che il proteasoma è di fondamentale importanza per la degradazione di proteine mal ripiegate, una questione vitale rimane indefinito: come proteine mal ripiegate sono specificamente riconosciuti e mirati per la degradazione. Inoltre, anche se i sistemi PQC sono stati identificati in compartimenti cellulari compreso il citoplasma, il reticolo endoplasmatico, e il mitocondrio, i sistemi PQC nel nucleo rimangono poco chiari 2.
Recenti studi nostro laboratorio hanno identificato un sistema che riconosce e degrada una varietà di proteine mal ripiegate nel nucleocellule di mammiferi 9. Questo sistema è composto da proteine promielocitica (PML), una proteina nucleare e un membro della famiglia di proteine tripartita motivo contenenti (TRIM), e RNF4, un anello di dominio contenenti proteine. PML, e diverse altre proteine TRIM, in possesso di SUMO (piccolo modificatore ubiquitina-simile) E3 ligasi attività, che facilita la specificità e l'efficienza delle proteine SUMOylation 10. RNF4 appartiene a un piccolo gruppo di ubiquitina ligases SUMO mirati (Stübl), che contengono uno o più motivi di sumo-interagenti (SIMS) in aggiunta al dominio anello che consente loro l'attività ubiquitina ligasi 11. Abbiamo scoperto che PML riconosce specificamente proteine mal ripiegate attraverso discrete siti di riconoscimento substrato che può discernere caratteristiche distinte sulle proteine mal ripiegate. In seguito al legame, tag PML misfolded proteine con poli-catene di Sumo2 / 3, due quasi identici proteine SUMO mammiferi che possono formare poli-catene a causa dell'esistenza di un sito SUMOylation interna. Sproteine mal ripiegate UMOylated vengono poi riconosciuti da RNF4, che conduce alla loro degradazione ubiquitination e del proteasoma. Abbiamo inoltre dimostrato che il sistema di PML-RNF4 è importante per la protezione contro la neurodegenerazione, come carenza di PML aggrava i difetti comportamentali e neuropatologici di un modello murino di tipo SCA 1 (SCA1) 9.
Per distinguere la degradazione delle proteine da altri meccanismi cellulari che possono regolare i livelli di proteine, i tassi di turnover proteico è stato misurato 9. Tra i metodi più frequentemente utilizzati per determinare il ricambio proteico sono inseguimento del polso e cicloesimide Chase (CHX). Questi due metodi esaminano nel tempo, rispettivamente, le proteine con radioisotopo di interesse in cellule di traduzione-abile e proteine totali preesistenti di interesse in cellule di traduzione inibito. Tuttavia, una grande sfida per studiare proteine patogeni e misfolding incline è che l'emivita di queste proteine può essere estremamente long. Ad esempio, Ataxin-1, Ataxin-7, huntingtina, α-sinucleina e TDP-43 tutti hanno tempi di dimezzamento di più di 12 a 24 ore 9,12-16. I tassi di turnover lente di queste proteine precludono l'uso dell'analisi CHX chase perché le cellule che ospitano queste proteine non possono sopravvivere inibizione traduzione prolungata, particolarmente perché le proteine mal ripiegate stessi possono essere altamente tossici per le cellule. L'analisi pulse-chase con etichettatura isotopica può anche essere difficile per le proteine che sono altamente aggregazione-prona. La maggior parte dei saggi pulse-chase basano su immunoprecipitazione per separare la proteina di interesse da tutte le altre proteine che sono anche marcato radioattivamente. Questa procedura normalmente include procedure di immunoprecipitazione e di lavaggio lunghi, durante i quali gli aggregati SDS-insolubili possono formare, rendendo l'analisi con SDS-PAGE elettroforesi imprecisa.
Qui un protocollo per analizzare le proteine mal ripiegate nucleari con un tasso di turnover lento è descritto 9. Una forma patogena di Ataxin-1 (ATXN1) che contiene un tratto di 82 glutamines (ATXN1 82Q) viene utilizzato per questo scopo 8. Quando espresso in cellule, una maggiore green fluorescent protein (GFP) fusione di forme ATXN1 82Q microscopiche inclusioni visibili nel nucleo (Figura 1A). Analisi Pulse caccia rivela che il tempo di dimezzamento di Ataxn1 82Q è di oltre 18 ore 9. ATXN1 82Q è composta da specie con conformazioni mal ripiegate di caratteristiche diverse, nonché specie con conformazione nativa. È probabile che queste specie sono degradati a velocità diverse, e pertanto dovrebbe essere analizzato separatamente. Lisati da ATXN1 82Q-GFP-cellule che esprimono sono frazionati in NP-40-solubili (solubile o NS, probabilmente rappresentano proteine native o mal ripiegate proteine monomeriche / oligomerica) e (NI, aggregati / misfolded) porzioni NP-40-insolubile. Quest'ultimo può essere ulteriormente suddiviso in SDS-solubili (SS; probabili aggregati disordinati) o SDS-resistente (SR; probabili fibrille amiloidi) Frazioni (Figura 1B). frazioni NS e SS possono essere analizzati mediante SDS-PAGE seguita da western blotting, mentre la frazione SR può essere rilevato tramite saggi filtro di ritardo seguiti da immunoblotting. CHX chase è combinato con il metodo di frazionamento del detersivo, e ha scoperto che l'emivita di SS ATXN1 82Q è molto più breve di quella di NS ATXN1 82Q e totale ATXN1 82Q (Figura 2A), indicando che la frazione SS può essere facilmente riconosciuto e degradato nelle cellule 9. Così, questo metodo fornisce un potente strumento per studiare la dinamica di proteine mal ripiegate e per confrontare il loro modello di degrado.
Noi descriviamo anche un metodo che è adatto per screening ad alta per identificare macromolecole o piccoli composti che possono modulare la degradazione delle proteine mal ripiegate. Questo metodo si basa su un mutante conformazionalmente destabilizzata di lucciola luciferasi (LucDM) 17, un substrato modello di chaperone. Abbiamo fusibiled LucDM ad un segnale di localizzazione nucleare (NLS) per sondare il sistema PQC in questo compartimento cellulare, e GFP (NLS-LucDM-GFP) per comodità di rilevamento. Forme NLS-LucDM-GFP microscopicamente aggregati nucleari visibili in una piccola percentuale di cellule (Figura 3A). Simile a ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP-ma non la sua wild-type omologo NLS-LucWT-GFP-viene modificato da Sumo2 / 3 e regolamentata dalla via PML-RNF4 9. NLS-LucDM-GFP costituisce anche SS e le specie SR, anche se le quantità relative di SS e di specie SR sono minime rispetto a NS, utilizzando le condizioni di cui al protocollo 3. Per semplificare l'analisi, abbiamo solo analizziamo SDS LucDM solubile (compresi sia gli NS e frazioni SS) per SDS-PAGE e Western Blot. Importante, assay chase CHX mostrato che l'emivita di SDS-solubile NLS-LucDM-GFP è molto più breve di quella del suo wild-type controparte (Figura 3B), suggerendo che LucDM è un substrato specifico per il sistema che riconosce e si degradaproteine mal ripiegate.
La degradazione di LucDM-GFP provoca un calo significativo segnale complessivo di fluorescenza. Pertanto, abbiamo anche sviluppato un protocollo per la rilevazione in tempo reale di cellulari LucDM-GFP mediante test a base di fluorescenza micropiastre. Molti sistemi schermo high-throughput (HTS) sono sviluppati per i farmaci o geni modificatori aggregati cellulari e vitalità cellulare causate da proteine aberranti 18-20. Tuttavia, molto pochi HTS sono specificamente progettati per il targeting degrado in cellule di mammifero. Questo protocollo serve come sistema robusto per analisi rapide e su larga scala degli effetti di espressione proteica, l'abbattimento e trattamento farmacologico sulla degradazione di proteine misfolded cellulare. Utilizzando cellule HeLa come ad esempio, di seguito descriviamo i protocolli per l'analisi di queste due proteine mal ripiegate. I saggi possono essere applicati anche ad altre linee cellulari, anche se può essere necessario ottimizzato per singole linee cellulari condizioni di trasfezione e decorso.
Protocol
Representative Results
Discussion
I meccanismi che regolano la degradazione delle proteine misfolded sono essenziali per mantenere l'omeostasi delle proteine cellulari, e che probabilmente rappresentano bersagli farmacologici preziose per trattare malattie neurodegenerative e altre malattie proteine misfolding. Qui, saggi che esaminano la degradazione delle proteine misfolded sono descritti, utilizzando una proteina patogena ATXN1 (ATXN1 82Q) ed un mutante nucleare localizzata luciferasi (NLS-LucDM) come esempi.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
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