Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.
Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by β-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.
Skelett- och hjärtmuskelsammandragning utlöses av sarko nätmagen Ca2 + frisättning medierad av Ryr. Det finns tre däggdjurs Ryr isoformer med funktionskanalen består av fyra identiska subenheter. Varje Ryr subenheten består av en stor cytoplasmisk reglerings N-terminala delen och en liten C-terminala delen som innehåller de transmembrandomäner som bildar en hög konduktans Ca2 + por. Onormal intra- och inter-subenheten interaktioner bakom Ryr kanal dysfunktion och resultera i neuromuskulär och hjärtsjukdomar 1. Identifieringen och karakteriseringen av specifika domäner som är involverade i Ryr struktur: funktion relation är därför av avgörande betydelse för förståelsen av Ryr patofysiologi.
Traditionella biokemiska protein-proteininteraktions tekniker kräver betydande mängder renat protein, som ofta produceras i bakterier. Detta är inte möjligt i fallet med Ryr, en mycket stor membran protein består av ~ 5000 aminosyror, medan dess rekombinanta fragment inte lätta att bakteriell expression och rening. Sålunda beskrivs alternativa expressionssystem som inbegriper eukaryota värdceller som krävs för däggdjurs integrerade membranproteiner. Vi har tidigare anställd Y2H, co-IP och tvärbindningsanalyser för att kollektivt visa att N-terminal tetra är ett strukturellt drag som är konserverat över tre däggdjurs Ryr isoformer 2,3. Viktigt, har vi funnit att en enda punktmutation i samband med arytmogena hjärtsjukdom stör N-terminal självassociation och resulterar i en dysfunktionell Ryr kanal 4. Vi har också tillämpats dessa tekniker för att oligomerisering studier av Ryr cytoplasmatiska C-terminala svansen 5 såväl som N-änden av den homologa intracellulära Ca2 + frisättning kanal, inositol 1,4,5 trisfosfat receptor 2.
I Y2H analysen, den interactipå mellan två proteiner (X och Y) mäts genom rekonstitution av en funktionell transkriptionsfaktor (GAL4) och den efterföljande aktiveringen av reportergener 6-9. Två olika kloningsvektorer används för att generera fusioner av de två testade proteiner med de två fysiskt separerbara, oberoende domäner av GAL4: DNA-bindande domän (DNA-BD) / protein X fusion (bete) och aktiveringsdomän (AD) / protein Y fusion (mål). Den Y2H kan användas för att testa om ett protein interagerar med sig själv genom att generera GAL4 DNA-BD och AD fusioner av samma protein. Genetiskt modifierade Y2H stammar GAL4 och GAL80 bristfällig (den GAL80-proteinet är en repressor av GAL4), liksom TRP1 och LEU2 bristfällig (för att ge närings val för bete och bytes plasmider, respektive). I jästen kärna, är de rekombinanta DNA-BD och AD-peptider bringas i nära fysisk närhet för att producera en hybrid GAL4 transkriptionsfaktor endast genom fusioner "X: Y interaction. Detta tillvägagångssätt möjliggör snabb genetisk screening för att detektera protein-proteininteraktioner genom parallell transkriptionell aktivering av prototrofa (HIS3 som kodar för ett enzym som krävs för histidin-biosyntes) och kromogen (LacZ som kodar för β-galaktosidas (β-Gal)) reportergener. Den största fördelen med den Y2H är att det är en in vivo-analys som detekterar även svaga eller transienta protein-proteininteraktioner. Dessutom involverar detektion den enkla användningen av urvals tillväxt (i media som saknar histidin) eller av en kolorimetrisk (β-Gal) -analys utan behov av rening av betet och målproteiner eller generering av specifika antikroppar. Dessutom kan Y2H användas för att screena en samling av slumpmässiga okända kloner (cDNA-biblioteksklonerna fuserade till GAL4 AD) för nya bindningspartners av en betesprotein, också ger direkt tillträde till cDNA av biblioteket proteinet.
Att förlänga Y2H observationer, två friståendeent biokemiska tekniker kan användas. Co-IP och tvärbindningsanalyser i kombination med immunoblotting är metoder som används för att detektera proteinföreningar i komplexa provblandningar, t ex., Hela cellysat 10. Deras huvudsakliga fördel är att de rapporterar om protein-proteininteraktioner från naturlig vävnad, till skillnad från andra metoder som kräver användning av rekombinanta proteiner. Rekombinanta proteiner kan också användas, typiskt uttryckt i en cellinje från däggdjur, där de sannolikt kommer att ha sina korrekta konformation och posttranslationella modifieringar, såväl som subcellulära lokalisering. Eftersom emellertid co-IP och tvärbindning är in vitro-analyser som använder sig av homogeniserade celler, är det nödvändigt att bekräfta huruvida de två proteinpartners är co-lokaliserad i den intakta cellen 11. Vi använder rutinmässigt transfektion av däggdjurs HEK293-celler att övergående uttrycka däggdjurs integrerad membran och cytosoliska proteiner med användning av kalciumfosfatfällningsmetoden 2-4,12-14, Beskrivs här i detalj. Detta är ett billigt sätt att effektivt leverera den plasmid-DNA inuti celler, men det är beroende av den särskilda cellinjen som används och cellsammanflödet, samt renheten hos plasmid-DNA 11,15.
Co-IP analys involverar isolering av det nativa eller rekombinant protein av intresse från cellysat under icke-denaturerande betingelser som möjliggör samtidig rening av förmodade interaktionspartners 10,16. Det kräver användning av två oberoende antikroppar, den immunoprecipitating antikropp för isolering av protein X, och immunoblotting antikropp för detektion av proteinpartner Y. Den kan användas för att testa om ett protein interagerar med sig själv genom att generera två olika fusioner med två annan epitop taggar (eg., HA och cMyc). Den immunoprecipitating antikroppen är bunden via sin Fc-region på Protein-A (eller protein-G, beroende på den djurart, där antikroppen togs upp), vilketkonjugeras till agaros (eller Sepharose) harts. Protein X utfälles genom antikropp: protein-A-harts efter inkubation med cellysatet, nämligen detergent-lösliga fraktionen av homogeniserade celler. Proteinimmunkomplex elueras med SDS-innehållande buffert och analyserades därefter med SDS-PAGE och immunoblotting med användning av en antikropp för att detektera närvaron av protein Y 17. Co-IP bör utföras med detergent lösliga proteiner för att undvika överdriven icke-specifik bindning. Valet av tvättmedel och dess koncentration, liksom antalet tvättar, bör optimeras för varje X: Y par 10,16,18.
Tvärbindning används för att bestämma stökiometrin hos den oligomera proteinkomplex. Den är baserad på en kemisk reaktion för att skapa kovalenta bindningar mellan intilliggande samverkande protomerer, och därför möjliggör den bevara proteinets oligomera status under SDS-PAGE-separation. Det finns många tvärbindnings Reagents av olika längd och kemi inriktade på olika reaktiva grupper på proteiner, typiskt primära aminer, karboxyl eller tiolgrupper. Här beskriver vi användningen av glutaraldehyd (OHC (CH2) 3 CHO), en homo-bifunktionella tvärbindare med två aldehydgrupper på vardera änden som reagerar med fria aminogrupper som är närvarande i lysinrester 19,20. Tvärbindning följs på ett koncentrations eller tidsberoende sätt som resulterar i adduktbildning. Glutaraldehyd Reaktionen stoppas med hydrazin (H 2 NNH 2) och proteinprover analyseras sedan med SDS-PAGE och immunoblotting 17 för att utvärdera deras oligomerisering tillstånd. Vi bör notera att tvärbindning inte inducerar oligomerisering utan endast skapar stabila broar mellan befintliga proteinkomplex. Viktiga överväganden vid utför tvärbindningsexperiment innefattar valet av tvärbindningsmedel, dess koncentration och reaktionstiden 19,20.
Bildningen av protein homooligomerer är en grundläggande biologisk process som reglerar aktiviteten av transkriptionsfaktorer, enzymer, jonkanaler och receptorer 25,26. Viktigt har protein oligomerisering även patologiska konsekvenser inklusive neurodegeneration och arytmogena hjärtsjukdom 4,27. De metoder som beskrivs i denna artikel används för att identifiera domän domän interaktioner förmedlar protein självassociation och oligomerisering. Nedan pekar vi på kritiska steg inom varje protokoll, och vi diskutera viktiga överväganden, begränsningar och felsökning.
Den Y2H Systemet kan användas först för att screena för potentiella interagerande protein partner på grund av dess relativt high throughput screening, användarvänlighet och mycket reproducerbara resultat. Y2H procedurer utförs i en mikrobiologiskt laboratorium med standard (platta eller shaker) inkubatorer och rum inneslutning anläggningar. Användning av freshly framställda kompetenta celler (steg 1.1.8) är avgörande för hög effektivitet jäst omvandling, medan för bästa resultat i β-Gal-analyser, nyligen vuxit jästkolonier (upp till 5 dagar gamla) bör användas (steg 1.2.3). System baserade på andra än GAL4 och / eller ytterligare / alternativa reportergener transkriptionsfaktorer finns, och därför bete och bytes plasmider bör matchas med lämplig Y2H stammen.
Vissa stammar bör odlas i närvaro av 3-amino-1,2,4-triazol, en kompetitiv inhibitor av HIS3-proteinet, för att släcka eventuella konstitutivt uttryck av HIS3-reportergenen 7,8. Expression av bete och mål fusionsproteiner bör kontrolleras genom immun 17. I fall bete / rov fusionsproteiner är giftiga för jäst, kan lägre tolererbara proteinnivåer åstadkommas genom kloning i olika vektorer där betes / rov expression drivs av en annan promotor. Vidare är det viktigt att se till thatt bete / byte fusionsproteiner visas inte självständig reporter genaktivitet. Autonoma reporter genaktivering kan räddas genom att modifiera konstruktionen för att ta bort den ansvariga regionen, eller genom att byta GAL4 DNA-BD och AD fusioner för de två testade proteinerna. Dessutom är transmembrandomäner bättre utelämnas från bete / rov konstruktioner, eftersom de kan orsaka felveckning eller mislocalization av fusionsproteiner i intracellulära membran fack. I själva verket är den största nackdelen med Y2H systemet att betet och målproteiner är lokaliserade i jästkärnan bort från deras fysiologiska subcellulär lokalisering och potentiellt saknar specifika posttranslationella modifieringar, vilket resulterar i falskt positiva eller falskt negativa interaktioner 6-9 .
Däggdjurs heterologa expressionssystem är bättre lämpade för studier av däggdjurs integrerade membranproteiner i form av konformation, post-translationella modifieringar och subcellulär lokalisering.En av de mest använda cell transfektion metoder är kalciumfosfatutfällning, främst på grund av den minsta utrustning och reagenser krävs 11,15. Alternativa metoder, nämligen elektroporering, liposomer, katjoniska lipider och polymerer, kan ge högre transfektionseffektivitet beroende på cellinje och konstruktion som används. I allmänhet är de primära faktorer som påverkar transfektionseffektiviteten är plasmid-DNA-kvalitet och cell hälsa / viabilitet. De bästa resultaten uppnås när plasmid-DNA av högsta renhet (260 nm / 280 nm absorbans förhållande av ~ 1,8) och aktivt delande celler används. Celler bör därför transfekteras vid ej mer än 60 – 70% sammanflytning (steg 2.1.2), eftersom förmågan att ta upp främmande DNA är relaterad till ytarean av cellen exponeras för mediet 11. Dessutom är införandet av antibiotika i odlingsmediet under transfektion (steg 2.1.3) rekommenderas inte på grund av ökad celldöd 15.
Feller kalciumfosfatutfällning särskilt noggranna förberedelser och pH-justering (till 7,05 exakt) i 2x HBS-lösning (steg 2.1.1), och korrekt bildning av plasmid DNA / kalcium / fosfatkomplex av kraftig omblandning (steg 2.1.5) är kritiska steg för högeffektiv transfektion. Typiskt proteinuttryck genom transient transfektion toppar inom 24-72 timmar.
När cellerna skördas, måste efterföljande procedurer utföras vid 4 ° C för att minimera proteasaktivitet, och tillsats av proteashämmare rekommenderas. Cell homogenisering bör följas av ett centrifugeringssteg för att avlägsna kärnor eftersom kromosomalt DNA kan öka lösningsviskositet och öka icke-specifik bindning. Således är homogenisering på mekanisk väg i en iso-osmotisk buffert föredras, vanligtvis i (0,3 M) sackaros eller (150 mM) NaCl. I allmänhet är sackaros-baserade buffertar känd för att öka proteinstabilitet och reducera potentiell icke-nativt protein aggregation, men på grund av preferential hydratisering på proteinytan, är elektrostatiska protein-proteininteraktioner gynnas. Omvänt, saltbaserade buffertar påverkar nettoladdningen av laddade grupper aminosyrasido på proteinytan, vilket har en slagsida mot flera hydrofoba baserade interaktioner 28.
Co-IP är den mest vanligtvis används biokemisk analys för att bedöma protein-proteininteraktioner i synnerhet från naturliga vävnaden. Dess huvudsakliga nackdelen är kravet på mycket specifika antikroppar validerade för användning i IP och immunoblotting 10,16,18. Sålunda är rekombinanta proteiner ofta märkta med en peptid-epitop, t ex., Influensa hemagglutinin (YPYDVPDYA) eller humant cMyc (EQKLISEEDL), för vilka med hög affinitet specifika antikroppar är kommersiellt tillgängliga. Om så önskas kan immunoprecipitating antikroppen kemiskt konjugerad på Protein-A harts för att undvika dess eluering och detektion under immunoblotting stadiet som kan skymma co-utfällda protein 16; För att uppnå detta har vi framgångsrikt använt kemiska tvärbindare 3,3'-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24. Det är absolut nödvändigt att en lämplig detergent ingår i IP-buffert och det olösliga materialet av homogeniserade celler avlägsnas genom centrifugering för att minimera icke-specifik bindning (steg 3.1.3). Valet och koncentrationen av rengöringsmedel är viktiga faktorer: starkare rengöringsmedel och / eller högre koncentrationer skulle avsevärt minska icke-specifik bindning men kan också upphäva X: Y proteininteraktion, medan lägre koncentrationer eller mildare rengöringsmedel kan tillåta en svag växelverkan som skall iakttas, men kan resultera i överdriven icke-specifik bindning. Mellanliggande hållfasthets detergenter är föredragna, t.ex. Triton X-100 vid 0,5 -. 1% koncentration. För att ytterligare minska icke-specifik bindning, en neutral protein (t.ex. bovint serumalbumin vid 100 | ig / ml) kan inkluderas i IP-buffert, och / eller cellysatet kan förinställas Cleared med föregående inkubering med protein-A enbart harts. Antalet tvättar bör optimeras för X: Y par testas, vanligtvis tre 10-minuterstvättar med IP-buffert (steg 3.1.9). I varje fall bör en co-IP-prov med icke-immun-IgG som den immunoprecipitating antikropp alltid behandlas parallellt för att fungera som negativ kontroll (steg 3.1.6).
Den största fördelen med kemisk tvärbindning är att den informerar om den stökiometriska sammansättningen av proteinet homo-oligomer. Glutaraldehyd är ett vanligt använt tvärbindningsmedel, eftersom det inte kräver någon specialutrustning och det genererar termiskt och kemiskt stabila tvärbindningar mellan interagerande proteiner 19,20. Föreningar med fria aminogrupper bör utelämnas från analysbuffertar (steg 3.2.1) eftersom de kommer att släcka den kemiska reaktionen. Glutaraldehyd koncentration och reaktionstiden (steg 3.2.4) bör optimeras för den oligomera proteinkomplex av intresse. Den huvudsakliga nackdelen med denna teknik, especibundsförvant när det utförs på hela cellpreparat, är den icke-specificiteten av den kemiska reaktion som skulle kunna ge artificiella proteinaggregat som saknar biologisk betydelse.
Alternativt in vivo (t ex., Fluorescensresonansenergiöverföring, bi-molekylära fluorescens eller luminescens komplemente) och in vitro-tekniker (t.ex.., Storleksuteslutande kromatografi, analytisk ultracentrifugering, isotermisk titrering kalorimetri) är tillgängliga för karakterisering av proteinsjälvassociation och bedömning av oligomerisering stökiometri 29,30. Varje metod har sina egna fördelar och nackdelar, och det kan vara mer lämpade för studier av ett specifikt protein, beroende på proteinrening / stabilitet och utrustning / reagens tillgänglighet. De tre kompletterande metoder som beskrivs här i detalj, nämligen Y2H, co-IP och tvärbindning, har använts i kombination för att ge övertygande bevis för RyR2 homo-oligomer bildning i isolering och i en levande cell.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av British Heart Foundation stipendier till SZ (FS / 08/063 och FS / 15/30/31494).
1. PART 1 yeast two-hybrid | |||
Plate incubator | Hereaus | B6120 | Used at 30°C |
Orbital shaker incubator | New Brunswick Scientific | INNOVA 4300 | Used at 30°C with shaking at 230-250 rpm |
Spectrophotometer | Perkin Elmer | Lambda Bio+ | To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay |
Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit | Takara Clontech | K1604-1 | Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2 and yeast strain Y190 |
Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y0626 | To prepare minimal SD growh medium |
Dropout supplement lacking leucine and tryptophan | Sigma-Aldrich | Y0750 | To prepare minimal SD growh medium |
Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine | Sigma-Aldrich | Y2001 | To prepare minimal SD growh medium |
Herring testes carrier DNA | Takara Clontech | 630440 | For yeast transformation |
Whatman filter paper Grade 5 | Sigma-Aldrich | WHA1005070 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | B4252 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | N1127 | for use in liquid b-Gal assay |
PART 2. Protein expression in a mammalian cell line | |||
HEK293 cell line | ATCC | ATCC® CRL-1573™ | |
Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) | SANYO | MCO-18AIC | To culture mammalian cells |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) | Invitrogen (ThermoFisher) | 41966 | To prepare growth medium for mammalian cells |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen (ThermoFisher) | 10500 | To prepare growth medium for mammalian cells |
Glass beads | Sigma-Aldrich | G8772 | To homogenise cells |
Needle 23G (0.6 x 30mm) | BD Microlance | 300700 | To homogenise cells |
Protease inhibitor cocktail (Complete) | Roche | 11873508001 | To prevent proteolysis |
PART 3. In vitro biochemical methods | |||
Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) | Bio-Rad | 1658000EDU | For polyacrylamide gel electrophoresis |
Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) | Bio-Rad | 1703940 | For electrophoretic transfer |
Compact X-ray film processor | Xograph | X4 | For use in immunoblotting |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | For use in chemical cross-linking |
Protein-A sepharose beads | GE Healthcare Life Sciences | 17-5280-01 | For use in co-IP assay |
Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-805 | For use in co-IP assay |
Non-immune rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | For use in co-IP assay |
Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | For use in immunoblotting |
Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) | Covance | MMS-101P | For use in immunoblotting |
Anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | For use in immunoblotting |
Hyperfilm ECL | GE Healthcare Life Sciences | 28906836 | For use in immunoblotting |
ECL Western Blotting Substrate | Pierce (ThermoFisher) | 32106 | For use in immunoblotting |