The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.
Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.
Under mitose, er kromosomerne fra den replikerede genom organiseret på cellens ækvator at sikre lige fordeling af søsterchromatider over nydannede datterceller. Kromosom positionering og adskillelse er medieret af deres tilknytning til spindel mikrotubuli oprindelse fra to modsatrettede centrosomer. Ud over at sikre trofast kromosom fordeling, orienteringen af den mitotiske spindel dikterer også celledeling plane 1. Koordineret orientering af celledeling er afgørende i mange faser af udvikling og for vævshomeostase 2. Specifikt kan reguleres mitosespindelen positionering resultere i den asymmetriske fordeling af cellulære indhold eller selv producere datterceller af forskellig størrelse 2. Mitosespindelen montage og orientering starter i profase og orkestreret af et komplekst samspil mellem samarbejde og antagonisering kraft-generatorer 3,4. De genererede kræfter består af bOTH trække og skubbe kræfter. Disse kræfter stammer både fra spindel kontakter med cellen cortex såvel som inde fra spindlen, og kan dannes ved mikrotubulusdynamik samt ved molekylære motorer og tværbindere (figur 1).
Skubbekræfter kan genereres når mikrotubuli vokse mod stive strukturer såsom cellen cortex. Afhængigt af den totale modstand kraft genereres i systemet, kan dette resultere i repositionering af den mitotiske spindel (lave kræfter) eller udløse mikrotubulus foldning eller katastrofe (høje kræfter) 5-8. Mængden af kraft, der kan frembringes ved at skubbe afhænger mikrotubulus længde, idet længden er en stærk determinant for mikrotubulus-buckling 9. Desuden kan mikrotubuli, der stammer fra en centrosom skubbe mod den anden centrosom, en mekanisme, der er blevet foreslået at drive centrosom adskillelse i begyndelsen profase 3,10.
I annoncenbetingelse for at skubbe kræfter, der genereres ved voksende mikrotubuli, ender mikrotubuli kontakt mellem cellen cortex kan også mægle trække kræfter 11. Undersøgelser fra flere laboratorier har vist, at den kontrollerede aktivitet af kortikale kraft generatorer er påkrævet til den asymmetriske placering af mitotiske spindler in vivo 1. Afgørende for disse trækkræfter er cortex-lokaliserede cytoplasmatisk dynein (herefter benævnt »dynein«), et minus-ende rettet mikrotubuli motor protein 8,12,13. For eksempel i knopskydende gær, laterale interaktioner af cortical dynein med mikrotubulus gitter resulterer i motor-afhængig mikrotubulus glider langs cortex 14. Imidlertid kan corticale trækkræfter også frembringes ved evnen af dynein til dannelse fra enden vedhæftede filer til depolymerisering mikrotubuli 8. Den energi, der genereres af mikrotubuli svind kan føre til kræfter, der er generelt en størrelsesorden højere (~ 50 PN (referere 15 </sup>)) end de kræfter, der genereres af individuelle motordrevne proteiner (~ 7-8 PN (ref. 16)). End-on fastgørelse af kortikale dynein til depolymerisering mikrotubuli fremmer spindel positionering i spirende gær 17 og C. elegans 13. Hvorvidt både motor-afhængige glidende og mikrotubulusdepolymerisation drevet kortikale trækkræfter kan samarbejde eller udelukker gensidigt hinanden in vivo i øjeblikket ukendt.
Foruden mikrotubuli skubbekræfter og dynein-medieret kortikale trækkræfter, er centrosom positionering kontrolleres indefra mitosespindelen af talrige andre proteiner. Kinesin-5 motorer, for eksempel eksistere som tetramerer, der kan tværbinde antiparallelle interpolar mikrotubuli, hvilket resulterer i dannelsen af passiv glidende kræfter 18-20. Medlemmer af kinesin-5 motor familien er nødvendige for centrosom separation og bipolar spindel samling i alle eukaryoter undersøgte, med undtagelse af C. elegans (revideret i henvisning 21).
Endvidere er diffunderbare tværbindere af Ase1 / PRC1 familie også kendt for at lokalisere til overlappende mikrotubulus regioner af interpolar mikrotubuli in vivo og in vitro 22-27. De kræfter, der genereres af Ase1-drevet udvidelse af det overlappende mikrotubulus-region er store nok til at opveje kinesin-14 medierede glidende kræfter in vitro 28,29. I celler, der Ase1 / PRC1 kræves for stabil dannelse af overlappende mikrotubuli regioner i spindlen Mellemzone 25-27,30, hvilket antyder, at de kræfter, der genereres af diffunderbare tværbindere betydeligt kan bidrage til spindel organisation. Endelig styrker fra den mitotiske kromatin og kinetochores indflydelse mitosespindelen samling og positionering gennem forskellige veje 3. Da disse komponenter er ikke en del af rekonstituering assays beskrevet her, vil de ikke blive diskuteret i detaljer.
jove_content "> Der findes forskellige teorier om, hvordan de forskellige molekylære komponenter og kræfter er beskrevet ovenfor samarbejder spindel samling og positionering, men vi er stadig langt fra en kvantitativ forståelse. Ud over eksperimenter i levende celler, in vitro-forsøg med oprensede komponenter giver en kraftfuld rute til at hjælpe nå dette mål. Her præsenterer vi en visuel guide til en tilpasset og udvidet version af de nyligt offentliggjorte metoder (Roth et al. 31), hvor grundlæggende spindler rekonstitueres i vand-i-olie emulsion dråber, startende med en minimalt antal komponenter. Ved hjælp af mikrofluide teknikker, er sfæriske dråber genereret med størrelser, der er sammenlignelige med mitotiske celler. Inden for disse dråber, kan oprensede centrosomer og tubulin kombineres for at studere mikrotubuli aster dynamik, tvinger generation og aster-aster interaktioner. Ved indføre kortikale (såsom dynein) og inter-polære (såsom kinesin-5 / Ase1) kraft-generatorer, virekonstituere stadig mere komplekse spindel-lignende strukturer, der begynder at ligne in vivo situationen.Metoderne beskrevet her tilstedeværende seneste bestræbelser på at rekonstruere grundlæggende mitosespindler i vand-i-olie emulsion dråber. Studere spindel samling inden geometriske grænser giver mange fordele. findes vigtige feedback-mekanismer mellem mikrotubuli i mitotiske spindel og de geometriske begrænsninger, de er samlet. Mikrotubuli kan generere skubbe kræfter, når de vokser i geometriske grænser, hvilket kan resultere i mitosespindelen forskydning. Desuden kan udvikle sig til en fysisk barriere inducere mikrotubulus katastrofer. Desuden kan spindelenhed inden for en begrænset geometri føre til en gradvis udtømning af individuelle komponenter, såsom tubulin, hvilket igen påvirker direkte mikrotubulus vækstrate 36. Disse er alle vigtige faktorer, spindel samling, som kan studeres ved anvendelse af de beskrevne assays her.
De beskrevne analyser er meget følsomme over for små koncentration ForskelNCES af dråben komponenter. Dette er tilfældet for tubulin, hvor mindre koncentrationsforskelle kan resultere i enten for langsomt eller for hurtigt mikrotubulus vækst. I dette tilfælde mikrotubuli vækstrater kan ofte stadig korrigeres ved justering af temperaturen under den første ~ 30 min af eksperimentet. Mitosespindelen montering og positionering er også meget følsom over for variationer i koncentrationen af (cortical) kraft generatorer. Dette vil sandsynligvis afhænge af koncentration, renhed og aktivitet af de oprensede komponenter, og skal titreres omhyggeligt for hver nyligt oprenset protein.
Desuden kan visse afvejninger skal foretages i imaging indstillinger, afhængigt af arten af assayet. Oprindeligt høje niveauer af opløselige fluorescerende tubulindimerer gør det vanskeligt at billeddata individuelle mikrotubuli. Som mikrotubuli vokser længere og opløselig tubulin langsomt tømt, signal-til-støj-forholdet bliver gradvist højere og tillader billeddannelse af indival mikrotubuli. I modsætning til opstillinger med åbne systemer, den geometriske indespærring forhindrer udveksling af fluorescerende molekyler og oxygen scavenger systemkomponenter inden en bulk reservoir, hvilket resulterer i betydelig blegning. Især til overvågning spindel samling og positionering over tid, er det nødvendigt at billedet med lave lysintensiteter, selv i nærvær af en potent oxygen scavenger system.
Disse metoder gør det muligt for bottom-up rekonstituering af forenklede spindel-lignende strukturer in vitro. Ud over de komponenter, der er indført her, har mange andre faktorer blevet beskrevet at påvirke bipolar spindeldannelse, positionering, orientering, formning osv 3. Dette system kan udvides yderligere til at studere de enkelte og kombinerede effekter af ekstra kraft generatorer. Vigtige bidragsydere til spindeldannelse, der i øjeblikket fraværende fra dette system er de mitotiske kromosomer. Mitotisk chromatin har vist sig atdirekte spindel dannelse af (1) chromokinesins der kan generere såkaldte polar-ages styrkers 3, (2) dannelse af en RanGTP gradient af kromatin-bundne RanGEF RCC1 38, (3) kinetochores, der kan interagere med (depolymerisering ) mikrotubuli 39 og (4) kromatin selv, som kan fungere som en mekanisk fjeder imellem modstående mikrotubuli 40.
Endelig giver det beskrevne system i øjeblikket begrænset tidsmæssig og rumlig kontrol over aktivitet og lokalisering af indførte kraft-generatorer. I celler, mange spindel forsamling faktorer lokalisere til bestemte rum eller er aktive inden for et begrænset tid-vindue. Et slående eksempel er aktiviteten af dynein, som er specifikt beriget på den bageste side af C. elegans én-celle stadiet embryo at fremme asymmetrisk spindel positionering og celledeling. I dette system, er vi i øjeblikket undersøger muligheden for at efterligne en sådan temporal og asymmetriske aktivitet ved hjælp af metoder, lånt fra opto-genetiske teknikker. Derudover, som det er tilfældet for C. elegans embryo og celler med en stiv cellevæg, at mange celler ikke runde op i mitose. Formen af den geometriske indespærring vil have en afgørende indflydelse på de kræfter, der virker på spindlen 41. Det vil derfor være vigtigt at rekonstruere spindel samling og positionering i ikke-sfæriske dråber så godt, potentielt bruge mere komplekse mikrofluide systemer, der tillader at forme og opbevaring af emulsionsdråber 42,43. Endelig i væv, celle-celle og celle-substrat signalering og tilknytning give eksterne signaler, der kan oversættes til dirigeret spindel orientering, som det ofte observeret i epitelceller og stamceller. Alle disse specialiserede aspekter er ikke blevet taget i betragtning i denne aktuelle undersøgelse og kan give fremtidige udfordringer til at bygge i retning af flere in vivo-lignende rekonstitutioner af mitosespindelen assembly og positionering.
The authors have nothing to disclose.
We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).
1. Preparation of microfluidic chips | |||
Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
SU-8 3025 | MicroChem | ||
Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0> 10-20 Ω-cm, 500-550μm, SSP, w/2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
Spin coater | Polos | SPIN150I | |
PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
2. Microfluidic setup | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
Glass pipets | |||
Glass tubes | |||
Vacuum pump | Laboport | KNF | |
Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
Sonicator | Branson | M2800H | |
Coverslips | 24x60mm, thickness 1.5 | ||
Glass-slides | 26x76mm | ||
Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
Laboratory sealing film | Parafilm | ||
Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
BSA – Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
4. Introducing spindle-assembly factors | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥ 97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |