التحقيق استنادا التدخل-RNA من وظيفة من حرارة صدمة بروتين 27 خلال شفاء القرنية طلائي الجرح
Summary
Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.
Abstract
Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.
Introduction
الخلايا الظهارية القرنية (CECS) يتم تسليط مستمر في فيلم المسيل للدموع، في حين يتم استبدالها في وقت واحد من قبل خلايا من حوف والقرنية الطبقات القاعدية الظهارية. يمكن 1 مختلف الضغوطات خارجي تحفز الخلايا والتقشر من CECS. 2 بروتينات الصدمة الحرارية (شركائنا HSPs) يتم حفظها للغاية ويمكن تقسيمها إلى عائلتين وفقا لحجم الجزيئي. وتضم 3 أسرة أكبر HSP HSP90، HSP70، وHSP60، وتضم الأسرة الصغيرة HSP27. 4 ومن المعروف أن الفسفرة من HSP27 للعب دورا هاما في بقاء الخلية ومطلوب للهجرة الخلايا بسبب دور هذا البروتين في إعادة الأكتين 5-7 لذلك، حاولنا لاختبار الدور المحتمل للHSP27 الفسفرة في الهجرة لجنة الانتخابات المركزية وموت الخلايا المبرمج في نموذج في المختبر من التئام الجروح الظهارية.
تدخل الحمض النووي الريبي (رني) باستخدام إما صغيرة أو قصيرة الرنا التدخل (سيرنا) له جنرال الكتريكالفائدة nerated في كل الأحياء الأساسية والتطبيقية، كما يحتمل أن يسمح للتعبير عن أي الجينات في المصالح أن طرقت إلى أسفل. 8 وهنا، كنا سيرنا HSP27 محددة لتقييم مساهمة HSP27 لالتئام الجروح لجنة الانتخابات المركزية وموت الخلايا المبرمج. طرق رني التقليدية لجين تدق إلى أسفل في الخلايا تستخدم الدوبلكس RNA الاصطناعية، من بينهم اثنان معدلة أليغنوكليوتيد] 21-مير التي يمكن تجميعها لإنشاء الرناوات siRNAs. ورني سيرنا التي استخدمناها في هذه الدراسة هي طريقة بسيطة وفعالة للغاية ل transfect الخلايا، وهذا كاشف يعمل مع مختلف خطوط الخلايا خلد. في هذه الدراسة، ونحن لشرح الطرق المستخدمة لهذا التحليل، بما في ذلك فحص الناجم عن الصفر الجرح الاتجاه، النشاف الغربي، سيرنا ترنسفكأيشن الفحص، الفحص المناعي، والتدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this present study, we evaluated the potential role of HSP27 in corneal epithelial wounding using in vitro approaches. The critical steps involved siRNA transfection for HSP27 knock-down to observe the function of HSP27 in cells subjected to stress. Notably, a role for HSP27 was revealed by these experiments in epithelial cell migration and apoptosis during corneal epithelial wound healing. Unlike previous studies10 that used rat HSP27-specific siRNA to transfect vascular smooth muscle cells, we us…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل منحة بحثية طالب (13-14) من جامعة كلية للطب أولسان، سيول، كوريا ومنحة (2014-464) من معهد اسان لعلوم الحياة، سيول، كوريا.
Materials
| Biological safety cabinet | CHC LAB Co.Ltd, Daejeon, Republic of Korea | CHC-777A2-06 | Class II, Type A2 |
| Stealth RNAi™ siRNA | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA | |
| BEGMTM | Lonza, Inc., Walkersville, MD | CC-3171, CC4175 | Bronchial epithelium growth medium |
| Protease inhibitor | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | P8340 ,P7626 | 1 uM Pepstatin A, 1 uM Leupetin, 0.1 uM Aprotin |
| Bradford protein assay | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | #500-0001 | Bradford protein assay |
| Nitrocellulose filters | Amersham, Little Chalfont, UK | RPN3032D | Western blotting membrane |
| Non-phosphorylated HSP27 | Abcam Inc., Cambridge, MA | ab12351 | 1:1000 dilution (Total HSP27) |
| Phosphorylated HSP27 (Ser85) | Abcam Inc., Cambridge, MA | ab5594 | 1: 1000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85 |
| Lipofectamine® RNAiMAX reagent | Invitrogen, Carlsbad, CA | 13-778-075 | Transfection reagent |
| Phosphorylated Akt (Ser473) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4060 | 1: 1000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker) |
| Non-phosphorylated Akt | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4061 | 1:1000 dilution (Total Akt) |
| Bcl-2-associated X protein | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4062 | 1: 1000 (anti-apoptotic protein marker) |
| GAPDH | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | No. 4063 | 1:1000 loading control marker (house keeping gene) |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | NCI1460KR | 1:10000 dilution |
| OPTI-MEM | Invitrogen, Carlsbad, CA | 31985 | reduced serum medium for transfection |
| Image analysis software | Olympus, Inc., Tokyo, Japan | Image-Pro Plus 5.0 | |
| Skimed milk powder | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany | T145.2 | |
| Tris | Amresco LCC, Inc. Solon, OH | No-0497 | |
| Sodium Chloride | Amresco LCC, Inc. Solon, OH | No-0241 | |
| Six well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | 140675 | 35.00 mm diameter / well |
| 24-well culuture dish | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | 142475 | |
| Orbital shaker | N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea | NB1015 | |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | sc-2323 | |
| BDFACSCantoTM II | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | Flow cytometry | |
| X-Ray Film | Kodak, Rochester, NY | Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen | |
| western blotting luminol reagent | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | sc-2048 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 556547 |
References
- Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. Corneal epithelial wound healing. Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).
- Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. Apoptosis in shed human corneal cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).
- Guay, J., et al. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J. cell. Sci. 110, 357-368 (1997).
- Park, J. W., et al. Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina. Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).
- Rane, M. J., et al. Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation. J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).
- Shin, K. D., et al. Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation. J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).
- Jain, S., et al. Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing. Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).
- Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O’Rand, M. G. Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45 (2009).
- Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea. Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).
- Voegeli, T. S., Currie, R. W. siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells. Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).
- Shi, B., Isseroff, R. R. Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27). J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).
- Shen, E. P., et al. Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations. Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).
- Song, I. S., et al. Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing. Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).
