Nous illustrons ici un essai de liaison membranaire in vitro dans lequel les interactions entre le Gag du VIH-1 et les membranes lipidiques sont analysées visuellement à l’aide de Gag marqué YFP synthétisé dans un système de traduction in vitro basé sur des germes de blé et de GUVs préparés par une technique d’électroformation.
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Article de méthode
Visualisation du VIH-1 Gag Reliure Giant unilamellaires vésiculaires (GUV) Membranes
Dans cet article
Résumé
Résumé
La protéine structurale du VIH-1, Pr55 Gag (ou Gag) se lie à la membrane plasmatique dans les cellules au cours du processus d'assemblage du virus. liaison de Gag membrane est une étape essentielle pour la formation de particules de virus, car un défaut dans les résultats de liaison de la membrane Gag en déficience grave de la production de particules virales. Pour avoir des détails mécanistiques des interactions avec la membrane lipidique Gag, des procédés in vitro basés sur la RMN, la protéine empreinte, la résonance plasmon de surface, des liposomes flottation centrifugation ou de la fluorescence des lipides bourrelet liaison ont été développés jusqu'à présent. Cependant, chacune de ces méthodes in vitro a ses limites. Pour surmonter certaines de ces limitations et de fournir une approche complémentaire aux méthodes précédemment établies, nous avons développé un test in vitro dans lequel les interactions entre le VIH-1 Gag et membranes lipidiques ont lieu dans un environnement "cellule-like". Dans cet essai, la liaison Gag à des membranes lipidiques est analysé visuellement à l'aide YFP Taggebase de germe d Gag synthétisé dans un blé dans le système de traduction in vitro et GUVs préparés par une technique de électroformation. Nous décrivons ici le contexte et les protocoles d'obtenir Myristoylated pleine longueur protéines Gag et les membranes GUV nécessaires pour le dosage et pour détecter la liaison par microscopie Gag-GUV.
Introduction
l'immunodéficience humaine et le virus de type 1 (VIH-1) est un virus enveloppé qui se réunit à partir des bourgeons et la membrane plasmique (PM) dans la plupart des types de cellules. L'assemblage du VIH-1 des particules virales est entraîné par la protéine virale du noyau 55 kDa , appelée Pr55 Gag (GAG). Gag est synthétisée sous la forme d'une polyprotéine précurseur composée de quatre domaines structuraux principaux, à savoir, la matrice, capside et nucléocapside, p6, ainsi que deux peptides espaceurs SP1 et SP2. Lors de l'assemblage, la matrice (MA) domaine est responsable pour le ciblage de Gag sur le site d'assemblage, la capside....
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Protocole
Jour 1: Expression des protéines Gag Utilisation de la transcription in vitro traduction-based System-Lysate Germe de blé
1. Préparation du VIH-1 gag
- Retirez tous les réactifs du kit de CECF de germe de blé commercial de congélateurs (lysats de germe de blé sont stockés à -80 ° C, d'autres réactifs à -20 ºC). Décongeler sur la glace et mélanger les composants comme indiqué dans le tableau 1.
| Mix-1 (alimentation mix) | |
| solution d'alimentatio.... |
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Résultats
En utilisant le protocole ci-dessus, nous avons préparé GUVs composés de POPC + POPS + Chol (rapport molaire: 4,66: 2,33: 3). Cette composition a été choisi pour refléter approximativement les PS et le cholestérol des concentrations de PM. Robuste et liaison de Gag efficace a été observée seulement lorsque le cerveau PI (4,5) P 2 a été inclus dans le mélange POPC + POPS + Chol-PI cerveau (4,5) P 2 [rapport molaire (POPC + POPS + Chol + : 4: 2: 3: 1] dans cet e.......
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Discussion
L'essai de liaison de GUV tel que décrit ci-dessus donne une bonne alternative dans des scénarios où d'autres dosages d'interactions protéine-lipide ont leurs limites. Ce test nous permet d'examiner les interactions entre les myristoylée Gag pleine longueur et des lipides acides avec des chaînes acyles native de longueur dans le contexte de la bicouche lipidique et faire sans de longues flottation centrifugation à travers à haute densité des gradients de saccharose ou d'autres traitements post-liaiso.......
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Déclarations de divulgation
Nous déclarons que nous n’avons pas d’intérêts conflictuels.
Remerciements
Nous tenons à remercier Mohammad Saleem, Jing Wu et Krishnan Raghunathan pour des discussions utiles. Nous remercions également Priya BEGANI d'assistance pendant le tournage. Ce travail est soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde R01 AI071727 (AO) et R01 GM110052 (SLV).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Multimètre numérique | Meterman | 30XR | Un multimètre générique capable de mesurer la résistance et les volts fera l’affaire. |
| Générateur de fonctions | Instek | GFG-8216A | Un générateur de fonctions générique capable de générer une onde sinusoïdale à 10 Hz et 1 V est suffisant. |
| Lames en verre revêtu d’ITO | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubateur | Hoefer | Tout incubateur capable de maintenir avec précision la température sera suffisant | |
| Chambre à vide | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Seringue | Hamilton | 80400 | Jauge 22S, Seringue numéro 702 |
| Kit de base en élastomère PDMS Sylgard, Dow-Corning | Sylgard, 184 | ||
| RTS 100 Germe de blé Kit CECF | BiotechRabbit, Berlin, Allemagne | BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA ; | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Albâtre, AL ; | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholestérol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Cerveau-PI(4,5)P2 ; | Avanti Polar Lipids | 840046X |
Références
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A.
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Réimpressions et autorisations
