אנו מדגימים כאן מבחן קשירת ממברנה במבחנה שבו אינטראקציות בין HIV-1 Gag וממברנות שומנים מנותחות ויזואלית באמצעות Gag מתויג YFP המסונתז במערכת תרגום במבחנה מבוססת נבט חיטה ו-GUVs שהוכנו בטכניקת אלקטרופורמציה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ויזואליזציה של HIV-1 Gag מחייב את הענק Unilamellar שלפוחיות (בוס) ממברנות
במאמר זה
סיכום
תקציר
החלבון המבני של HIV-1, Pr55 Gag (או Gag), נקשר הממברנה בתאים במהלך תהליך ההרכבה וירוס. ממברנה עקדת Gag היא מהווה נדבך חיוני להיווצרות חלקיק וירוס, מאז פגם בתוצאות מחייב קרום Gag ליקוי חמור של ייצור החלקיקים ויראלי. כדי לקבל פרטים מכניסטית של אינטראקציות קרום שומנים Gag, שיטות חוץ גופייה מבוססת על תמ"ג, footprinting חלבון, תהודת plasmon פני שטח, צנטריפוגה הנפקת liposome, או חרוז שומני קרינת כריכה פותח עד כה. עם זאת, כל אחת משיטות במבחנה אלה יש מגבלות. כדי להתגבר על כמה מגבלות אלה ולספק גישה משלים לשיטות הוקמו בעבר, פתחנו assay במבחנה שבה אינטראקציות בין HIV-1 Gag וממברנות שומנים להתקיים בסביבה "דמוי תא". ב assay זה, Gag מחייב ממברנות שומנים בדם מנותח ויזואלית באמצעות YFP-taggeד Gag מסונתז ניבט חיטה מבוססת במערכת תרגום במבחנת GUVs שהוכן על ידי טכניקת electroformation. כאן נתאר את הרקע ואת הפרוטוקולים להשיג חלבונים Gag באורך מלא myristoylated וממברנות Guv הכרחי עבור assay וכדי לזהות Gag-בוס מחייב ידי מיקרוסקופ.
מבוא
סוג 1 הנגיף (HIV-1) הכשל החיסוני האנושי הוא וירוס אפוף כי מרכיב ב וניצנים מן הקרום פלזמה (PM) בסוגי תאים ביותר. הרכבה של חלקיקי הנגיף HIV-1 הוא מונע על ידי חלבון הליבה ויראלי 55 kDa שנקרא Pr55 Gag (GAG). Gag הוא מסונתז כמבשר polyprotein מורכב מארבעה תחומים מבניים גדולים, כלומר, מטריצה, קפסיד, nucleocapsid, ו P6, וכן שני פפטידים spacer SP1 ו- SP2. במהלך האסיפה, תחום מטריקס (MA) אחראי המיקוד של Gag לאתר ההרכבה, קפסיד (CA) תחום מתווכת אינטראקציות Gag-Gag, את nucleocapsid (NC) תחום מגייס RNA הגנומי ויראלי, וגרם מארח המתגייס P6 שסיוע scission חלקיק וירוס מן קרום הפלזמה. Gag גם הוא עובר שינוי שיתוף translational על ידי תוס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
יום 1: ביטוי של חלבונים Gag שימוש במערכת נבט חיטה Lysate מבוססי במבחנה תמלול-תרגום
1. הכנה של HIV-1 Gag
- הסר את כל ריאגנטים של ערכת CECF מסחרי נבט חיטה מן מקפיאים (lysates נבט חיטה מאוחסנים ב -80 ºC; חומרים כימיים אחרים ב -20 ºC). להפשיר אותם על הקרח ומערבבים את הרכיבים כפי שמוצג בטבלה 1.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש בפרוטוקול לעיל, הכנו GUVs המורכב POPC + POPS + חול (יחס טוחן: 4.66: 2.33: 3). רכב זה נבחר כ לשקף את ריכוזי PS וכולסטרול של ראש הממשלה. יציב ויעיל מחייב של Gag נצפה רק כאשר המוח-PI (4,5) P 2 נכלל לתוך תערובת POPC + POPS + החול (POPC + POPS + חול + המוח-PI (4,5) P 2 [יחס טוחן : 4: 3: 2 1] בדוגמה זו) (איור 4, להשוות לוחות B ו- D עם A ו- C). -YFP Gag מחייב GUVs המורכב POPC + פופס + חול + המוח-PI (4,5) .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
את assay מחייב Guv כמתואר לעיל מספק חלופה טובה בתרחישים בהם מבחני אינטראקציה חלבון-שומנים אחרים יש מגבלות שלהם. assay זה מאפשר לנו לבחון אינטראקציות בין Gag באורך מלא myristoylated ושומנים חומצי עם שרשרות acyl יליד באורך בהקשר השומנים bilayer ולעשות זאת בלי צנטריפוגה הנפקה ממושכת הדרך הדרגתית סוכרוז צפיפות גבוהה או עיבוד שלאחר מחייב אחר של Gag-שומנים מתחמים. יתרון נוסף הוא כי התנהגותם של Gag יכול להיבחן תערובת מורכבת (למשל, בנוכחות רכיבים cytosolic), אשר אינה מושגת בקלות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אנחנו מצהירים שאין לנו אינטרסים מנוגדים.
תודות
ברצוננו להודות מוחמד סלים, ג'ינג וו Krishnan Raghunathan לדיונים מועילים. אנו מודים גם פרייה Begani לסיוע במהלך הצילומים. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01 AI071727 (כדי AO) ו R01 GM110052 (כדי SLV).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מולטימטר דיגיטלי | Meterman | 30XR | מולטימטר גנרי שיכול למדוד התנגדות ווולט ישרת את המטרה. |
| מחולל פונקציות | Instek | GFG-8216A | מספיק מחולל פונקציות גנרי המסוגל ליצור גל סינוס ב-10 הרץ ו-1 וולט. |
| שקופיות זכוכית מצופות ITO | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | כל חממה שיכולה לשמור במדויק על הטמפרטורה תספיק | |
| תא ואקום | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| מזרק | המילטון | 80400 | מד 22S, מספר מזרק 702 |
| ערכת בסיס אלסטומר PDMS Sylgard, Dow-Corning | Sylgard, ערכת CECF נבט חיטה 184 | ||
| RTS 100 | BiotechRabbit, ברלין, גרמניה | BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | אוונטי ליפידים קוטביים, אלבסטר, AL | 850457C | |
| POPS | אוונטי שומנים קוטביים | 840034C | |
| כולסטרול | אוונטי שומנים קוטביים | 700041P | |
| מוח-PI(4,5)P<תת>2& | ליפידים קוטביים של Avanti | 840046X |
מקורות
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
