A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Zhengshan Zhao; Yassan Abdolazimi; Neali A. Armstrong; Justin P. Annes

doi:10.3791/54298

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Articolo metodologico

A High-contenuti

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DOI:

10.3791/54298

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16 luglio 2016

Zhengshan Zhao¹ , Yassan Abdolazimi¹ , Neali A. Armstrong¹ , Justin P. Annes¹

¹Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

sfide critiche per il campo di ricerca sul diabete sono di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la replicazione isolotto β-cellule e di sviluppare metodi per stimolando la rigenerazione delle cellule β-. Qui un metodo ad alto contenuto di screening per identificare e valutare l'attività di replica di promozione β-cellule di piccole molecole è presentato.

Abstract

La perdita di cellule β produttrici di insulina è una caratteristica centrale del diabete. Mentre si sta esplorando una varietà di potenziali terapie sostitutive, l'espansione delle cellule β delle isole pancreatiche endogene produttrici di insulina rimane una strategia interessante. β-cellule hanno una limitata attività rigenerativa spontanea; Di conseguenza, uno sforzo di ricerca cruciale è quello di sviluppare una comprensione precisa dei percorsi molecolari che frenano la crescita delle cellule β e di identificare farmaci in grado di superare queste restrizioni. In questo articolo viene presentato un metodo automatizzato di screening delle cellule primarie ad alto contenuto di immagini per identificare piccole molecole che promuovono la replicazione delle cellule β. Diversi limiti delle metodologie precedenti sono stati superati. In primo luogo, l'uso di cellule insulari primarie piuttosto che di una linea cellulare immortalizzata massimizza la ritenzione dei vincoli di crescita in vivo. In secondo luogo, l'uso di colture di cellule insulari a composizione mista piuttosto che di una linea di β cellule consente l'identificazione sia di stimolatori di crescita limitati al lignaggio che di stimolatori di crescita generali. In terzo luogo, la tecnica rende pratico l'uso delle isole primarie, una risorsa limitante, attraverso l'uso di un formato a 384 pozzetti. In quarto luogo, la dannosa variabilità sperimentale associata alla qualità irregolare della coltura delle isole viene superata attraverso l'ottimizzazione dei parametri di isolamento, dispersione, placcatura e coltura. In quinto luogo, le difficoltà di misurare in modo accurato e coerente il basso tasso di replicazione basale delle cellule endocrine insulari sono superate con parametri di immunocolorazione ottimizzati, acquisizione e analisi automatizzate dei dati; L'automazione migliora contemporaneamente la produttività e limita la distorsione dello sperimentatore. I limiti notevoli di questo test sono l'uso di colture di isole disperse che interrompono l'architettura delle isole, l'uso di roditori piuttosto che di isole umane e le limitazioni intrinseche di produttività e costi associati all'uso di cellule primarie. È importante sottolineare che la strategia è facilmente adattabile per gli studi di replicazione delle isole umane. Questo test è particolarmente adatto per studiare l'effetto mitogenico delle sostanze sulle cellule β e i meccanismi molecolari che regolano la crescita delle cellule β.

Introduzione

Diabete comprende una raccolta di disturbi che condividono il punto finale di omeostasi del glucosio perturbato comune. Sebbene i meccanismi patogenetici dei sottotipi di diabete sono distinte, che condividono la conseguenza della riduzione della massa β-cellule, cioè, la perdita di capacità di produzione di insulina ^1,2. Attualmente, le strategie di trattamento del diabete si basano su somministrazione cronica di insulina esogena, la stimolazione farmacologica della produzione di insulina o il miglioramento della sensibilità all'insulina, e raramente, il trapianto di isole pancreatiche o tutta ^3,4 pancreas. Purtroppo, il successo d....