Высокая-контент<em&gt; In Vitro</em&gt; Панкреатическими островками β-клеток репликации Discovery Platform

Zhengshan Zhao; Yassan Abdolazimi; Neali A. Armstrong; Justin P. Annes

doi:10.3791/54298

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокая-контент

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54298

⸱

16 июля 2016 г.

Zhengshan Zhao¹ , Yassan Abdolazimi¹ , Neali A. Armstrong¹ , Justin P. Annes¹

¹Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Критические проблемы для области исследования диабета должны понять молекулярные механизмы, которые регулируют репликацию β-клеток островков и разработать методы стимуляции регенерации β-клеток. При этом метод высокого содержания скрининга для выявления и оценки репликации способствующего активности β-клеток малых молекул представлена.

Аннотация

Потеря инсулин-продуцирующих β-клеток является центральным признаком диабета. В то время как изучаются различные потенциальные заместительные методы лечения, экспансия эндогенных инсулин-продуцирующих островковых β клеток поджелудочной железы остается привлекательной стратегией. β-клетки имеют ограниченную спонтанную регенеративную активность; Следовательно, важнейшей исследовательской задачей является достижение точного понимания молекулярных путей, которые ограничивают рост β-клеток, и определение лекарств, способных преодолеть эти ограничения. В данной работе представлен автоматизированный метод скрининга первичных клеток с высоким содержанием изображений для идентификации малых молекул, способствующих репликации β клеток. Преодолены некоторые ограничения предыдущих методологий. Во-первых, использование первичных островковых клеток, а не иммортализированной клеточной линии, максимизирует удержание in vivo ограничений роста. Во-вторых, использование культур островковых клеток со смешанным составом, а не β-клеточной линии, позволяет идентифицировать как ограниченные по линии, так и общие стимуляторы роста. В-третьих, этот метод делает практичным использование первичных островков, ограничивающего ресурса, за счет использования формата 384 лунок. В-четвертых, вредная экспериментальная изменчивость, связанная с неустойчивым качеством культуры островковых прокладок, преодолевается за счет оптимизации параметров выделения, диспергирования, гальванизации и культивирования. В-пятых, трудности точного и последовательного измерения низкой скорости базальной репликации островковых эндокринных клеток преодолеваются с помощью оптимизированных параметров иммуноокрашивания, автоматизированного сбора и анализа данных; Автоматизация одновременно повышает производительность и ограничивает систематическую ошибку экспериментатора. Заметными ограничениями этого анализа являются использование дисперсных островковых культур, которые нарушают архитектуру островков, использование островков грызунов, а не человека, и присущие им ограничения пропускной способности и стоимости, связанные с использованием первичных клеток. Важно отметить, что стратегия легко адаптируется для исследований репликации островков человека. Этот анализ хорошо подходит для изучения митогенного действия веществ на β-клетки и молекулярных механизмов, регулирующих рост β-клеток.

Введение

Диабет включает в себя совокупность расстройств, разделяющих общую конечную точку нарушенного гомеостаза глюкозы. Хотя патогенетические механизмы диабета подтипов различны, они имеют следствием пониженной β-клеточной массы, то есть, потери производства инсулина мощностью ^1,2. В настоящее время стратегии лечения диабета полагаются на хроническое введение экзогенного инсулина, фармакологической стимуляции выработки инсулина или повышения чувствительности к инсулину, и редко, трансплантация островков поджелудочной железы или всей поджелудочной железы ^3,4. К сожалению, успех этих стратегий является кратковременным и / или не в достаточной с....