Transplants concurrentiels pour l'évaluation des cellules souches hématopoïétiques de remise en forme
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
Hématopoïèse est un processus de régénération qui assure la reconstitution des cellules sanguines qui ont été perdus à cause de blessures, le rayonnement et la mort cellulaire. Ce procédé est assurée par des cellules souches hématopoïétiques (HSC) qui résident en grande partie dans la moelle osseuse adulte. En outre, les cellules souches hématopoïétiques peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques dans les maladies auto – immunes, des affections malignes hématologiques et de déficiences immunitaires 1. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes qui régulent la fonction HSC, y compris leur expansion proliférative et leur capacité à atteindre et engraft l'os receveur après la greffe osseuse. Bien que des études récentes ont rapporté plusieurs marqueurs de surface cellulaire, y compris les membres de la famille SLAM CD150 et CD48, pour enrichir prospectivement CSH adultes et CSH fœtales à environ 50% de pureté 2-4, la mesure standard d'or pour CSH fonctionnelle reste un test repeupler in vivo déterminer leur capacité à rétablir le sang cproduction ell dans un hôte irradié 5.
L'essai de repopulation clonale in vivo a été initialement développé par Till et McCulloch 6 et a depuis été affiné et étendu. Comme défini à l'origine, les CSH assurer la production de cellules sanguines à vie grâce à l'auto-renouvellement et la différenciation. Le transfert de CSH dans un destinataire irradié nous permet donc d'évaluer: leur capacité à se différencier grâce à l'analyse des différentes lignées de cellules sanguines (lymphocytes T, les lymphocytes B, les granulocytes, les monocytes) et leur capacité d'auto-renouvellement par la transplantation de série. L'essai devrait normalement impliquer la comparaison de la fonctionnalité et / ou de la quantité de deux populations de CSH, par exemple, les cellules provenant de deux souris de différents génotypes ou des cellules qui ont été traitées ou non traitées avec différents facteurs qui pourraient influer sur le maintien ou l' expansion de CSH en culture. chimérisme du donneur, ou la contribution des donateurs transférés CSH to la production de cellules sanguines peut alors être déterminée par analyse par cytométrie de flux dans le sang périphérique et la moelle osseuse en utilisant des marqueurs de surface cellulaire ou d'autres méthodes qui permet de distinguer les cellules du donneur dans le receveur, ou l'hôte. Les marqueurs les plus utilisés sont certainement les deux allèles du gène PTPRC ou de l' antigène CD45 leucocytaire 7 que nous avons choisi pour les exemples fournis ci – dessous.
L'essai de repopulation clonale peut être soit concurrentiel ou non concurrentiel. Dans un contexte non compétitif, CQH de contrôle et de test sont transférés dans des souris receveuses distinctes et les résultats pour chaque type de cellule est indépendant de l'autre. Dans un contexte concurrentiel, la fonction des deux essais et de contrôle CSH est mesuré par rapport à une population de concurrent CSH. Le protocole décrit ici utilise le paramètre concurrentiel, mais peut également être adapté pour les situations non concurrentielles. Les deux approches ont leurs avantages et leurs limites, et nous allons les comparer en détail dans lediscussion. Nous décrivons également des approches différentes pour assurer l'équité dans le nombre de transplantés CSH, expliquer comment adapter le dosage pour la quantification des CSH en limitant essai de dilution (LDA), et de fournir des exemples des deux greffes réussies ou non pour l'interprétation des résultats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici est conçu pour évaluer l'aptitude relative des donateurs (test) CSH contre concurrent connu CSH. La situation de la concurrence augmente la sensibilité relative de l'essai (plus susceptibles de détecter des baisses modérées dans la condition physique des cellules souches) et fournit un contrôle technique interne pour l'efficacité de l'irradiation et de l'injection. Cependant, il ne doit pas être utilisé comme une mesure absolue de HSC remise en forme; une diminution…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Roxann Hétu-Arbour pour l'aide à la conception de la figure et la démonstration des procédures. La recherche dans le laboratoire a été soutenu par une bourse de transition de la Fondation Cole, Découverte accorde pas. 419226-2012 du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et la Fondation canadienne pour l'innovation (FCI Leaders Fund accorde. 31377 pas). KMH est un junior chercheur-boursier du Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS).
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- . Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
