A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.
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Artículo de método
La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada
En este artículo
Resumen
Resumen
En el proceso omnipresente de fusión de la membrana de la apertura de un poro de fusión establece la primera conexión entre dos compartimentos separados anteriormente. Durante neurotransmisor o la liberación de hormonas a través de la exocitosis, el poro de fusión puede abrir y cerrar transitoriamente en varias ocasiones, la regulación de la cinética de liberación de carga. la dinámica de los poros también determinan el modo de reciclaje de vesículas; resellado resultados irreversibles en la fusión transitoria, "kiss-and-run", mientras que la dilatación conduce a la fusión completa. Para entender mejor los factores que gobiernan la dinámica de los poros, hemos desarrollado un ensayo para monitorizar la fusión de membranas mediante microscopía de fluorescencia polarizada de reflexión interna total (TIRF) con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución en un bioquímicamente bien definidas sistema in vitro. La fusión etiquetada de manera fluorescente pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas v-SNARE (V-SUV) con una doble capa de apoyo plana t-SNARE, apoyado en un cojín de polímero blando (t-SBL, bicapa t-apoyado), Se controla. El ensayo utiliza canales de flujo de microfluidos que garantizan un mínimo consumo de muestra, mientras que el suministro de una densidad constante de los SUV. La explotación de la mejora rápida de la señal después de la transferencia de las etiquetas de lípidos de la SUV de la LPS durante la fusión, la cinética de la transferencia de colorantes de lípidos se controla. La sensibilidad de la microscopía TIRF permite el seguimiento de las etiquetas de lípidos fluorescentes individuales, de los cuales difusividad de lípidos y tamaño SUV se puede deducir por cada evento de fusión. Los tiempos de liberación de colorante de lípidos pueden ser mucho más de lo esperado para el paso sin obstáculos a través de los poros abiertos de forma permanente. El uso de un modelo que asume el retraso de la liberación de lípidos se debe a poros parpadeo, un poro "apertura", la fracción de tiempo que el poro se mantiene abierto durante la fusión, puede ser estimado. Un marcador soluble puede ser encapsulada en los terrenos para el seguimiento simultáneo de los lípidos y la liberación de la carga soluble. Estas mediciones indican algunos poros pueden volver a cerrar después de perder una fracción de la carga soluble.
Introducción
La fusión de membranas es un proceso biológico universal, necesaria para el tráfico intracelular de lípidos y proteínas, la secreción, la fertilización, el desarrollo y la envolvió entrada del virus en organismos huésped 1-3. Para la mayoría de las reacciones de fusión intracelular, incluida la liberación de las hormonas y los neurotransmisores a través de la exocitosis, la energía para fusionar dos bicapas lipídicas se proporciona por formación de un haz de cuatro hélices entre las proteínas N-etilmaleimida sensible receptor de la proteína factor de unión soluble cognado (SNARE), anclada en la vesícula (v-SNARE) y la membrana diana (t-SNARE)
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Protocolo
1. Preparación de un bloque de PDMS para formar el canal de microfluidos
Figura 1. La microfabricación de la plantilla de celda de flujo y la preparación de bloques PDMS. (A) Diseño de una celda de flujo de cuatro canales que se ajusta sobre un cubreobjetos de vidrio 24 x 60 mm (parte inferior). Seis diseños idénticos están dispuestas para que quepan en una oblea de silicio de 10 cm (superior). (B) Cortar el bloque de PDMS espesor de aproximadamente 5-8 mm en una perfo....
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Resultados
Calidad SBL
Es crucial para verificar la calidad y fluidez de la SBL antes del experimento de fusión. La fluorescencia en el lado inferior, de vidrio de un canal microfluídico debe ser uniforme, sin defectos evidentes. Si una burbuja de aire pasa a través del canal, se suele dejar cicatrices visibles en el SBL. Si hay tan grandes cicatrices escala / defectos, no use ese canal. A veces los SUV puede adherirse a.......
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Discusión
La implementación exitosa del ensayo de fusión SUV-SBL descrito aquí depende críticamente de varios pasos clave, tales como la reconstitución funcional de las proteínas en liposomas, obteniendo SBLS de buena calidad, y la elección de los parámetros de imagen adecuados para detectar moléculas individuales. Aunque puede tomar algún tiempo y esfuerzo para tener éxito, una vez que el ensayo se lleva a cabo con éxito, proporciona una gran cantidad de información sobre el proceso de fusión no disponible en cualquier otro ensa.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) por el diseño y construcción del microscopio polarizado TIRF, a David Baddeley (Universidad de Yale) por su ayuda con la instrumentación de detección de dos colores, y a James E. Rothman (Universidad de Yale) y Ben O'Shaughnessy (Universidad de Columbia) y a los miembros de sus grupos por estimular las discusiones. EK cuenta con el apoyo de un premio Kavli Neuroscience Scholar Award de la Fundación Kavli y la subvención 1R01GM108954 de los NIH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos | |||
| Milli-Q (MQ) | agua Millipore | ||
| KOH | J.T. Baker | 3040-05 | |
| Etanol 190 Proof | Decon | ||
| Isopropanol | Fisher Chemical | A416P4 | |
| HEPES | AmericanBio | AB00892 | |
| Cloruro de Sodio (KCl) | AmericanBio | AB01915 | |
| Dithiothreitol | AmericanBio | AB00490 | |
| N-[2-hidroxietil] piperazina-N'-[ácido 2-etanosulfónico] (HEPES) | AmericanBio | AB00892 | |
| EGTA | Acros Organics | 409911000 | |
| Buffers | |||
| Tampón HEPES-KOH (pH 7,4) | 25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μ M EGTA, 1 mM DTT | ||
| fuertes | |||
| nbsp; | J.T. Baker | 9180-01 | en frasco de vidrio, PRECAUCIÓN, use EPI |
| Metanol | J.T. Baker | 9070-03 | en frasco de vidrio, PRECAUCIÓN, use PPE |
| Preparación de liposomas | |||
| Hermético al gas Jeringa Hamilton | Hamilton var. tamaños | solo use aringa de vidrio con solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v) | |
| Tubos de vidrio Pyrex Vista 11 ml, tapón de rosca de 16x100 mm tubo de cultivo | Pyrex | 70825-16 | limpiar a fondo, enjuagar con cloroformo |
| 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 16:0-18:1 PC (POPC) | Los lípidos polares Avanti | 850457 | Los lípidos vienen disueltos en CHCl3 o como polvo liofilizado en viales sellados. Alícuota en la apertura. Almacene el excedente en forma de películas lipídicas secas en atmósfera inerte a -20 °C. Mantenga las existencias en CHCl3/MeOH (2:1, v/v) a -20 °C. deje llegar a RT antes |
| de abrir 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sal de sodio), 18:1 PS (DOPS) | Avanti Polar Lipids | 840035 | igual que el anterior. |
| 1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 18:0-20:4 PE (SAPE) | Avanti Polar Lipids | 850804 | igual que el anterior. |
| L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (cerebro, cerdo) (sal de amonio), PI (4,5)P2 | Avanti Lípidos polares | 840046 | igual que los anteriores. |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (sal de amonio), 18:1 NBD PE | Avanti Lípidos polares | 810145 | igual que el anterior. |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio), 18:1 PEG2000 PE | Avanti Polar Lipids | 880130 | Igual que el anterior. |
| colesterol (lana ovina, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000 | Igual que el anterior. |
| Aceite DiD'; Aceite DiIC18(5) (1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindodicarbocianina Perclorato) | Sondas moleculares | D-307 | |
| Rotavapor R-210 | Buchi | R-210 | baño de calor por encima de Tm de lípidos usados |
| OG n-Octyl-β-D-Glucopiranoside | Affymetrix | 0311 | tienda a -20 ° C, vamos a RT antes de abrir |
| Shaker - Eppendorf Thermomixer R | Eppendorf | ||
| Slide-A-Lyze Casetes de diálisis, 20k MWCO, 3 ml | life technologies | 66003 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbentes | Bio-Rad | 1523920 | |
| OptiPrep Medio de gradiente de densidad | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Tubo de ultracentrifugación, pared delgada, ultratransparente, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Beckman SW41 Ti | |||
| SuflorhodaminaB | Sondas moleculares | S-1307 | |
| Econo-Columna Columnas de cromatografía, 2,5 y veces; 10 cm | Bio-Rad | 7372512 | |
| Sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17-0150-01 | |
| SYPRO Tinción de Gel de Proteína | Naranja Sondas Moleculares | S-6650 | 5,000x Concentrado en DMSO |
| PDMS block | |||
| Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona, PDMS | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Placa de Petri de vidrio Pyrex, 150 x 20 mm, completa con tapa | Corning | 3160-152 | |
| Perforadora - Punzón de biopsia reutilizable, 0,75 mm | World Precision Instruments | 504529 | |
| Punzonadora de orificios manual | Taladro SYNEO | MHPM-UNV | |
| .035 x .026 x 1.5 304 SS Punzón redondo recubierto de TiN | SYNEO | CR0350265N20R4 | : 0,9 mm, tamaño del orificio del punzón: 0,74 mm |
| Tubo Tygon Microbore de 0,25 mm de diámetro interior, 0,76 mm de diámetro exterior | Cole-Parmer | 06419-00 | 0,010" de diámetro interior, 0,030" de diámetro exterior |
| Tubo de silicona (0,51 mm de diámetro interior, 2,1 mm de diámetro exterior | Cole-Parmer | 95802-00 | 0,020" de diámetro interior, 0,083" de diámetro exterior |
| Cubreobjetos - limpieza de sala limpia | |||
| Schott Nexterion cubreobjetos de vidrio D | Schott | 1472305 | |
| limpiador de plasma | Harrick | PDC-32G | |
| pTIRF configuración y accesorios | |||
| IX81 cuerpo de microscopio | Olympus | IX81 | |
| EM Cámara CCD | Andor | ixon-ultra-897 | |
| Thermo Plate, etapa de microscopio calefactada | Tokai Hit | MATS-U52RA26 | |
| 1 ml jeringas de vidrio hamilton (4x) | bomba | 81365 | |
| kd Scientific | KDS-230 |
Referencias
- Sudhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323, 474-477 (2009).
- Wickner, W., Schekman, R. Membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 658-664 (2008).
- Harrison, S. C.
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Reimpresiones y permisos
