Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.
Placenta stammer fra en ekstra-embryonale afstamning, den trophectoderm. I peri-implantation murine blastocyst, vægmaleri trophectoderm celler differentierer til primær trofoblast kæmpeceller (TGCs), mens den polære trophectoderm overlejrer den indre cellemasse vokser på senere differentiere til sekundære TGCs. TGCs spiller en central rolle i udviklingen af placenta og er afgørende for en vellykket graviditet. Undersøgelse af transkriptionel regulering af specifikke gener under post-implantation udvikling kan give indsigt i TGCs udvikling. Celler af ectoplacental kegle (EPC) fra embryoner på 7-7,5 dage i drægtigheden (E7-7.5), der stammer fra den polære trophectoderm, differentiere i sekundære TGCs 1. TGCs kan studeres in situ, på kryostatsnit embryoner på E7 selv om antallet af TGCs er meget lav på dette stadium. En alternativ metode til at analysere sekundær TGCs er at bruge kortsigtede kulturer af individuelle EPC'er fra E7 embryos. Vi foreslår en teknik til at undersøge den transkriptionelle status af gener af interesse både in vivo og in vitro på enkeltcelle-niveau ved hjælp af fluorescerende in situ hybridisering (FISH RNA) at visualisere nascente transkripter. Denne teknik giver en direkte udlæsning af genekspression og muliggør vurdering af det kromosomale status TGCs, som er store endoreplicating celler. Faktisk et centralt element i terminal differentiering af TGCs er, at de forlader cellecyklussen og med talrige runder af endoreplication.This metode kan anvendes til at detektere ekspression af ethvert gen udtrykt fra autosomer og / eller kønskromosomer og kan give vigtig information i udviklingsmæssige mekanismer samt placenta sygdomme.
Pattedyr trofoblast kæmpeceller (TGCs) danner en barriere mellem mødres og embryonale væv. De mægle implantation og invasion af fosteret i livmoderen og spille kritiske roller i udvikling for dannelsen af moderkagen. De producerer flere vækstfaktorer (cytokiner) og hormoner af prolactin / placentalactogen familie og steroider, der er nødvendige for embryonisk vækst og overlevelse. TGCs er store, mononukleære og polyploide celler med en celle cyklus, endocycle, der består af skiftende S og G faser. Faktisk TGCs er endoreplicating celler, i stand til at gennemgå flere runder af DNA-syntese uden division 2. For at undersøge den transkriptionelle status af gener in vivo, in TGCs sammenlignet med andre embryonale og extraembryonic celletyper, kan spirende RNA FISH udføres in vivo på frysemikrotomsnit 3 ved specifikke efter implantation faser. TGCs er let genkendelige på strækninger på grund af their stor størrelse og deres transkriptionel gen aktivitet kan registreres, men deres antal på tidlige post-implantation faser er lav. Mangel på TGCs på E7 embryonale sektioner, førte os til at udføre kortvarige kulturer af embryonale trophectodermal væv for at opnå differentierede TGCs for at studere reguleringen af genekspression under trophectoderm udvikling. Desuden for at forblive som fysiologiske som muligt, etablerede cellelinjer dvs. trophectoderm stamceller (TS) er ikke altid egnet til at undersøge udviklingsmæssige mekanismer Generation af sekundære TGCs giver et værdifuldt værktøj til at studere patologiske graviditeter forbundet med defekter i TGCs grundet unormal gen regulering i mus.
Trophoblastceller af ectoplacental kegle (EPC) er forstadier for sekundære TGCs 4. Spontan differentiering af dyrkede EPC'er til sekundær TGCs er tidligere blevet rapporteret 5. Men i modsætning til de primære TGCs, undersøgelser af sekundær TGC differentiation har fortsat begrænset, presumablydue til vanskelighederne ved at isolere EPC eksplantater fri for enhver maternelle eller embryonale væv. Vi tilpasset disse metoder, for at udføre RNA FISH på sekundære TGCs afledt af individuelle embryo på E7, en udviklingsmæssig post-implantation fase, hvor TGCs er meget få, men kunne genereres fra EPC forstadier. RNA FISH at analysere nukleare primære udskrifter er aldrig blevet gjort på niveauet for den enkelt celle niveau på sekundære TGCs. Dette giver mulighed for præcis analyse af transskription og blev brugt til at vise på post-implantation trin 3 den epigenetiske ustabilitet TGCs.
Et klassisk eksempel på epigenetik i pattedyr, er X-kromosomet inaktivering (XCI) undersøgte i Heard lab 6. I denne proces en af de 2 X-kromosomer hos kvinder inaktiveres. Den ikke-kodende Xist transcript frakker X-kromosomet, hvorfra det udtrykkes hos kvindelige celler og udløser dæmpning af de fleste gener. Anvendelse af RNA FISH,spirende transkripter af X-bundne gener kan undersøges som kan akkumuleringen af Xist RNA på det inaktive X-kromosom (Xi). Vi beskriver her en procedure til at udføre RNA FISH på sektioner af post-implantation embryoner og på kortsigtede kulturer af EPC. Denne protokol tilpasset fra dem, der blev anvendt til at undersøge XCI ved differentiering kvindelige embryonale stamceller og præimplantations embryoner 7-11. Vi giver eksempler på XCI i kvindelige fostre in vivo, såvel som in vitro TGCs.
Nascent RNA FISH betegner en let og følsom fremgangsmåde til enkelt celle analyse af transkriptionsaktivitet i embryoniske væv på forskellige udviklingsstadier. Effekten af denne tilgang er evnen til at identificere forskellige embryonale afstamninger på et givent tidspunkt efter morfologiske kriterier. Dette kræver imidlertid også, at minimal baggrundsfluorescens er til stede. Enhver sådan baggrund gør identifikationen af forskellige embryonale regioner og celletyper udfordrende. For at sikre minimal baggrund, er der to kritiske skridt i denne protokol. Den første er kvaliteten af kryosektionen og det andet er effektiviteten (signal til støj-forhold) af RNA FISH, der afhænger af niveauet af genekspression og kvaliteten af sonden. For sidstnævnte er prober derfor altid testet på dyrkede celler på dækglas (embryonale stamceller eller somatiske celler) før anvendelse på sektioner.
I denne protokol, giver vi the teknikker forpligtet til at udføre RNA FISH analyse på TGCs fra to forskellige typer af prøveforberedelse (cryostatsektioner og primære kulturer af embryonale eksplantater). En sådan enkelt celle analyse giver mulighed for dynamiske ændringer i genekspression ved forskellige post-implantation trin der skal vurderes.
De metoder vi beskriver at generere sekundær TGCs (ved E7-7.5 post-implantation trin) blev anvendt i vores laboratorium for at studere de X-kromosominaktivering mønstre af en ekstra-embryonale afstamning som udgøres af TGCs på post-implantation faser. Ekstra fosterudviklingen hos gnavere afhænger af differentiering af TGCs. Faktisk TGCs er afgørende for placenta og dermed fosterudvikling. Fejl i TGC differentiering forårsage embryonale dødelighed (for review se reference 15). Transkriptionsaktivitet TGCs anvendelse af RNA FISH tilladt os at demonstrere en usædvanlig X-kromosom inaktivering status af en sådan celletype under museudvikling 3.
<p class = "jove_content"> De metoder, der præsenteres her for at opnå og studere sekundære TGCs kan anvendes til at studere molekylære veje i udviklingen af de vigtige ekstra-embryonale væv, de er en del af, både i normale og muterede mus. Disse fremgangsmåder kan tilpasses til at undersøge TGC udvikling i andre pattedyr. Vores analyse indebar brug af vildtype musefostre tillader os at vurdere den transkriptionelle aktivitet af forskellige gener i in vivo TGCs og i in vitro TGCs afledt af EPC eksplantat. Denne metode kunne udvides til analyse af transgene mus og / eller ved tilsætning af inhibitor-molekyler i dyrkningsmediet. Vi har med succes brugt denne metode af RNA FISH på en anden type TGCs, såsom primære TGCs som synes på et tidligere tidspunkt i mus udvikling, E3.0 blastocyts, hvilket kan være individuelt dyrket i 4-5 dage, hvor udviklede udvækst, de ICM er omgivet af store primære TGCs 16,17. Spirende udskrifter for forskelligegener såvel som Xist kunne visualiseres og kvantificeres ved hjælp af den samme RNA FISH metode 3.Kombineret immunofluorescens og RNA FISH kan også udføres på cryostatsnit samt in vitro dyrkede TGCs 3. Dette viser, at metoden er ganske robust, som primære transkripter er meget modtagelige for nedbrydning, og der er et absolut krav af RNase frie forbindelser. HVIS / RNA FISH giver yderligere oplysninger om transskription niveauer, cellulære lokalisering og proteinekspression, samtidig i en given celle. Selv sektioner af paraffinindlejret væv, der tidligere er blevet anvendt til at påvise spirende RNA i humane tumorer samtidig opretholde vævsmorfologi 18, i vore hænder, cryostatsektioner er mere hensigtsmæssige for at bevare både det spirende RNA og epitoperne kræves til påvisning af antistoffer under immunofluorescens .
Foruden RNA FISH, efter immunofluorescence, kan kromosomalt DNA FISH også udføres på sekundære TGCs anvendelse af prober mærket med fluorochromer, der ligner dem, der anvendes til RNA FISH 3. Fluorescerende prober kan enten være plasmider / fosmids eller BAC'er, mærket med fluorescerende dUTPs som anvendt her, og beskrevet i Chaumeil et al., 8. Alternativt kan fluorescerende mærkede oligonukleotider anvendes 19. Da DNA FISH ikke kræver streng-specificitet, kan oligonukleotidprober konstrueres til at målrette en af de to komplementære strenge i målregionen. Forgrenede DNA-prober, hvor signalforstærkning opnås ved to sekventielle runder af specifikke og formeringsprober kan også anvendes til at forbedre signal-til-støj-forhold af fisk signaler 20. Alternativt kan RNA-prober såsom riboprober anvendes selv i vore DNA-baserede prober sikre et højere afvejning mellem signalkvalitet, specificitet og brugervenlighed.
Endelig 3D-billede køb af virksomer væsentlig for at opnå den ønskede geografisk information i disse store celler, og kan udføres ved anvendelse af forskellige fluorescens mikroskoper, såsom Apotome mikroskop eller epifluorescens mikroskoper med udfoldning såsom Deltavision (GEH), eller andre mikroskoper egnede til billeddannelse vævssnit, og store (> 20 um) TGCs. Det skal bemærkes, at for enkelt kopi DNA loci, den punktformet signal detekteres af spirende RNA FISH eller DNA FISH kan ikke let kan påvises ved konfokal mikroskopi.
Afslutningsvis bør de metoder, vi beskriver her være nyttigt både for detaljeret analyse af TGS i en udviklingsmæssig sammenhæng, men også i andre situationer sygdom. Mange gener, der er involveret i TGC udvikling og funktion i gnavere er bevaret mellem gnavere og mennesker, såsom transkriptionsfaktorer, proteaser og celleadhæsionsmolekyler 21. Mus TGCs er en celle model for studere gener, der regulerer placenta udvikling end derfor giver indsigt i menneskelige placenta sygdomme. På grund af det faktum, at disse celler endoreplicating og da nogle cancerceller indgreb endocycle programmer, foruden gen amplifikationsprocesser fremgangsmåderne vi beskriver bør også være nyttige i enkeltcelle-undersøgelser er nødvendige for at undersøge mekanismer, der fører til genome ustabilitet i cancerceller .
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Sophie gournet om hjælp med illustrationer, Julie Chaumeil til at læse manuskriptet, huset facilitet dyret og imaging platform af enheden. Dette arbejde har modtaget støtte under programmet «Investissements d'Avenir» lanceret af den franske regering og gennemført af ANR med referencerne ANR-10-LabX-0044 og ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, den EpiGeneSys FP7 no. 257.082 Network of Excellence til EH, et ERC Advanced Investigators tildele nej. 250.367 og EU FP7 SYBOSS giver ingen. 242.129 til EH Forfatterne vil gerne anerkende Cell og Tissue Imaging Platform for Genetik og Developmental Biology Department (UMR3215 / U934) af Institut Curie, medlem af Frankrig-Bioimaging (ANR-10-InSb-04), for at få hjælp med lys mikroskopi.
Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
Coverslips 18×18 | VWR | 631-1331 | |
Coverslips 22×22 | VWR | 631-0125 | |
12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20°C |
Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
Cryostat | Leica | CM3050 |