इधर, एक विधि Streptolysin एस, ग्रुप ए स्ट्रेप्टोकोकस द्वारा उत्पादित एक स्रावित विष के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली का उपयोग कर, केरेटिनकोशिकाओं पर वर्णित है। इस प्रणाली को आसानी से संक्रमण के दौरान विभिन्न प्रकार मेजबान सेल पर अन्य secreted बैक्टीरियल प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों शक्तिशाली विषाक्त पदार्थों को मेजबान ऊतक के विनाश में सहायता करने के लिए, मेजबान कोशिकाओं में संकेत परिवर्तन शुरू करने के लिए या संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रियाएं हेरफेर करने के लिए छिपाना। तरीकों को सफलतापूर्वक शुद्ध करने के लिए विकसित किया गया है हालांकि और इन महत्वपूर्ण विषैलापन कारकों में से कई का उत्पादन, अभी भी कई जीवाणु विषाक्त पदार्थों जिसका अनोखी संरचना या व्यापक बाद translational संशोधनों उन्हें शुद्ध और इन विट्रो प्रणालियों में अध्ययन करने के लिए मुश्किल बना रहे हैं। इसके अलावा, यहां तक कि जब शुद्ध विष प्राप्त किया जा सकता है, वहाँ प्रासंगिक शारीरिक शर्तों के तहत एक विष के विशिष्ट प्रभाव का अध्ययन करने के साथ जुड़े कई चुनौतियों का सामना कर रहे हैं। मेजबान कोशिकाओं पर स्रावित बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में सबसे विष की एक बार की खुराक के साथ मेजबान कोशिकाओं incubating शामिल है। इस तरह के तरीकों खराब एक संक्रमण है, जहां विष लगातार द्वारा निर्मित है के दौरान क्या मेजबान कोशिकाओं को वास्तव में अनुभव अनुमानितबैक्टीरियल कोशिकाओं और संक्रमण के दौरान धीरे-धीरे जमा करने के लिए अनुमति दी। इस प्रोटोकॉल एक पारगम्य झिल्ली डालने आधारित जीवाणु संक्रमण प्रणाली के डिजाइन मानव उपकला केरेटिनकोशिकाओं पर Streptolysin एस, एक शक्तिशाली विष ग्रुप ए स्ट्रेप्टोकोकस द्वारा उत्पादित, के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए वर्णन करता है। इस प्रणाली को और अधिक बारीकी तरीकों जहां शुद्ध विष या बैक्टीरियल supernatants सीधे कोशिकाओं की मेजबानी के लिए लागू कर रहे हैं की तुलना में एक संक्रमण के दौरान प्राकृतिक शारीरिक पर्यावरण mimics। महत्वपूर्ण बात, इस विधि को भी मेजबान प्रतिक्रियाएं कि बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच संपर्क को निर्देशित करने के कारण कर रहे हैं के पूर्वाग्रह को समाप्त। इस प्रणाली को प्रभावी ढंग से मेजबान झिल्ली अखंडता, सेलुलर व्यवहार्यता, और सेलुलर संकेत प्रतिक्रियाओं पर Streptolysin एस (एसएलएस) के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया है। इस तकनीक को आसानी से एक स्रावित बैक्टीरियल कारक डी की विशिष्ट भूमिका की जांच करने के स्तनधारी मेजबान सेल प्रकार की एक किस्म पर अन्य स्रावित विषैलापन कारकों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकतासंक्रमण के पाठ्यक्रम uring।
मेजबान सेल संक्रमण के संदर्भ में बैक्टीरियल विषैलापन कारकों के समारोह को समझना बैक्टीरियल रोगजनन अनुसंधान के एक प्रमुख ध्यान केंद्रित है। 10 – कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों सक्रिय रूप से मेजबान ऊतक के विनाश में सहायता करने के लिए, मेजबान कोशिकाओं में संकेत परिवर्तन शुरू करने के लिए या संक्रमण 1 के दौरान प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रियाएं हेरफेर करने के लिए विषाक्त पदार्थों और अन्य घुलनशील कारकों छिपाना। तरीकों को सफलतापूर्वक शुद्ध करने के लिए विकसित किया गया है हालांकि और अध्ययन के लिए इन महत्वपूर्ण विषैलापन कारकों में से कई का उत्पादन, कुछ जीवाणु उत्पादों अद्वितीय संरचनाओं या व्यापक बाद translational संशोधनों कि शुद्धि के तरीकों के लिए उन्हें अड़ियल उम्मीदवारों बनाने के लिए और इस प्रकार इन विट्रो प्रणालियों में उपयोग करते हुए अलगाव में अध्ययन नहीं किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, ग्रुप ए स्ट्रेप्टोकोकस, जीवाणु रोगज़नक़ ग्रसनीशोथ से नेक्रोटाइज़िंग fasciitis और विषाक्त आघात सिंड्रोम से लेकर संक्रमण की एक बहुत बड़ी संख्या के लिए जिम्मेदार है, एक स्रावित का उत्पादनबैक्टीरियल विष Streptolysin एस (एसएलएस) 11 के रूप में जाना जाता है – 17। इस ribosomally उत्पादित पेप्टाइड Streptolysin एस जुड़े जीन (एसएजी) क्लस्टर द्वारा इनकोडिंग है, और परिपक्व उत्पाद का आकार 14 में 2.7 केडीए होने का अनुमान है – 17। Protoxin, सागा द्वारा इनकोडिंग, कई एंजाइमों (SagB, SagC, और SAGD) द्वारा पोस्ट-translationally संशोधित किया गया है परिपक्व, कार्यात्मक फार्म का उत्पादन करने के लिए 15 – 17। विष का असामान्य अमीनो एसिड अनुक्रम के साथ मिलकर इन बाद translational संशोधनों की जटिलता विष है कि आज तक 15,17 का प्रयास किया गया है सभी शुद्धि और संरचना व्याख्या के प्रयासों के साथ असंगत प्रदान की गई है। इन चुनौतियों का मेजबान रोगजनन में इस विष की विशिष्ट भूमिका निर्धारित करने के लिए जटिल प्रयासों की है।
मामलों में जहां शुद्ध विषाक्त पदार्थों या अन्य स्रावित कारकों की तैयारी या तो जटिल या संभव नहीं है, के लिए तंत्र मेंस्पष्ट इन उत्पादों के समारोह में परंपरागत रूप से छान बैक्टीरियल supernatants, जो तब कोशिकाओं 18 की मेजबानी के लिए लागू कर रहे हैं की तैयारी के माध्यम से अध्ययन किया गया है – 20। इस तकनीक के साथ जुड़े कई चुनौतियों का सामना कर रहे हैं। सबसे पहले, इन स्रावित कारकों, एसएलएस सहित कई, अधिक से अधिक या लगातार गतिविधि जब संग्रहीत और बाद में कोशिकाओं की मेजबानी करने के लिए लागू बनाए रखने के लिए नहीं है। साथ ही, जब supernatants एक भी समय बिंदु पर एकत्र कर रहे हैं और फिर कोशिकाओं की मेजबानी के लिए आवेदन किया है, यह मुश्किल है शारीरिक प्रासंगिकता का निर्धारण करने के लिए और प्राकृतिक संक्रमण प्रक्रिया है, जहां secreted कारकों संक्रमण के पाठ्यक्रम एक करने के दौरान जमा करने के लिए अनुमति दी जाती है के बारे में सीधा निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए physiologically प्रासंगिक एकाग्रता। 3,8 – यह दूसरी चुनौती न केवल बैक्टीरियल supernatants का उपयोग करने के लिए, लेकिन यह भी मेजबान सेल के अध्ययन 1 में शुद्ध विषाक्त पदार्थों का उपयोग करने के लिए लागू होता है। इन मुद्दों, एक पारगम्य झिल्ली INSE संबोधित करने के लिएRT-आधारित संक्रमण प्रणाली एक तरह से है कि इष्टतम विष गतिविधि को बनाए रखता है और यह भी बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच सीधे संपर्क के चर समाप्त में मेजबान कोशिकाओं पर एसएलएस के प्रभाव का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है। इस प्रणाली में, मानव उपकला कोशिकाओं में अच्छी तरह से एक दो कक्ष के नीचे कक्ष में एक monolayer में बड़े हो रहे हैं, और बैक्टीरिया ही अच्छी तरह के ऊपरी सदन में पेश कर रहे हैं। एक झरझरा झिल्ली (0.4 माइक्रोन pores) ऊपरी और निचले कक्षों को अलग करती है, की अनुमति secreted कारकों दो कक्षों के बीच आदान-प्रदान किया जा सकता है लेकिन बैक्टीरिया के पारित होने को रोकने। इस प्रणाली के मेजबान प्रतिक्रियाओं है कि केवल निरंतर स्रावित बैक्टीरियल घटकों के कारण होते हैं किसी भी प्रतिक्रियाओं ग्रुप ए streptococcal संक्रमण के दौरान सीधे संपर्क के माध्यम से हो सकता है कि नष्ट करते हुए की प्रभावी मूल्यांकन के लिए अनुमति दी गई है। एसएलएस के अलावा अन्य स्रावित बैक्टीरियल कारकों को भी झरझरा झिल्ली के माध्यम से पारित कर सकते हैं हालांकि, जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) सहित एक isogenic उत्परिवर्ती पैनल का उपयोग करते हैं, एक एसएलएस के.एन.ockout (ΔsagA) और एक गाथा पूरित तनाव (ΔsagA + कथा) मेजबान प्रतिक्रियाओं है कि कड़ाई से एसएलएस निर्भर हैं 21 की सटीक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।
हालांकि समान पारगम्य झिल्ली डालने सिस्टम स्रावित वायरल संक्रमण में शामिल घटकों, कैंसर जीव विज्ञान, और प्रतिरक्षा सेल प्रवास 22 के अध्ययन के लिए नियोजित किया गया है – 26, कुछ अध्ययनों मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरियल बातचीत से जुड़े इस दृष्टिकोण 6,27,28 का उपयोग किया है। यहाँ तक कि अध्ययन है कि बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए इस तरह की व्यवस्था कार्यरत है मुख्य रूप से पारगम्य झिल्ली डालने पर चढ़ाया एक उपकला या endothelial monolayer के माध्यम से भड़काऊ कोशिकाओं या बैक्टीरिया के प्रवास पर ध्यान केंद्रित किया है। पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली के साथ साथ वर्णित एक सरल और प्रभावी तरीका है कि एक झरझरा झिल्ली प्रभावी तरीके का आकलन करने के माध्यम से बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं की जुदाई पर निर्भर करता हैsecreted विष, एसएलएस, मेजबान झिल्ली अखंडता, सेलुलर व्यवहार्यता, सेलुलर संकेत पारगमन, और secreted मेजबान सेल कारकों पर की सीटीएस। इस तकनीक में एक संक्रमण के पाठ्यक्रम पर एक विशिष्ट जीवाणु कारक की भूमिका की जांच करने के लिए स्तनधारी मेजबान सेल प्रकार की एक किस्म पर अन्य स्रावित विषैलापन कारकों के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
इस के साथ साथ एक विधि बैक्टीरियल विष इन विट्रो प्रणाली में मानव उपकला केरेटिनकोशिकाओं पर Streptolysin एस के प्रभाव की जांच करने के लिए एक पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली का उपयोग वर्णित है। इस प्रोटोकॉल अन्य secreted बैक्टीरियल विषैलापन कारकों के अध्ययन के साथ ही वैकल्पिक मेजबान सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। 3,8,18 – – 20 यह हाल ही में विकसित प्रणाली प्रयोगात्मक विधियों कि शुद्ध विषाक्त पदार्थों या फ़िल्टर बैक्टीरियल supernatants 1 उपयोग पर कई लाभ प्रदान करता है। पारगम्य झिल्ली डालने आधारित प्रणाली के रूप में यह उत्पादन किया जाता है कोशिकाओं की मेजबानी के लिए प्रासंगिक बैक्टीरियल विष है, जो अधिक से अधिक विष गतिविधि को बनाए रखा जा करने की अनुमति देता है एक लगातार बनाए रखा खुराक प्रदान करता है और यह भी प्रयोगों के बीच स्थिरता बढ़ जाती है। साथ ही, इस प्रणाली को और अधिक बारीकी से स्रावित कारक समय पर जमा के रूप में संक्रमण की प्रगति की अनुमति देकर और elimi द्वारा शारीरिक शर्तों mimicsमनमाने ढंग से विशिष्ट विष सांद्रता का चयन करने की जरूरत nating कोशिकाओं की मेजबानी के लिए लागू करने के लिए। इसके अलावा, इस प्रणाली को भी जांचकर्ताओं का आकलन करने के लिए ब्याज की एक जीवाणु कारक संपर्क निर्भर तरीके में कोशिकाओं की मेजबानी करने के लिए दिया जाता है कि क्या साधन प्रदान करेगा। संपर्क-निर्भरता अक्सर isogenic जीवाणु पालन में या अभिकर्मकों कि पालन को रोकने के उपयोग के माध्यम कमी म्यूटेंट की पीढ़ी के माध्यम से परीक्षण किया है। यहाँ वर्णित प्रणाली के पूरक हैं या इन पारंपरिक तरीकों को बदलने के लिए एक सरल विकल्प प्रदान करेगा।
प्रोटोकॉल की धारा 5 में वर्णित परीक्षण किया अनुप्रयोगों के अलावा, अन्य अनुप्रयोगों जो इस संक्रमण प्रणाली को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता साइटोकाइन सरणियों और एलिसा assays के लिए नमूनों के संग्रह में शामिल करने के लिए। इन दोनों मामलों में, LDH रिलीज assays के लिए वर्णित है कि एक समान प्रोटोकॉल का पालन किया जा सकता है। हालांकि यहां नहीं दिखाया गया है, इस प्रणाली को प्रभावी ढंग से एक होने के लिए मेजबान सेल के नमूने एकत्र करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैप्रवाह cytometry द्वारा nalyzed। इस आवेदन में, पारगम्य झिल्ली डालने संक्रमण अवधि के बाद हटा दिया जाता है, कोशिकाओं सेल संस्कृति के माध्यम से दूर करने के लिए धो रहे हैं, और trypsin विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के संग्रह की अनुमति के लिए आवेदन किया है। क्योंकि यह बड़ी पालन बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं है कि अन्यथा प्रवाह से सटीक सेल गिनती के साथ हस्तक्षेप कर सकता है के शामिल समुच्चय के गठन को रोकने में मदद करता है मेजबान कोशिकाओं से बैक्टीरिया के भौतिक जुदाई इस आवेदन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।
हालांकि बहुत संगत मेजबान प्रतिक्रियाओं जब पारंपरिक प्रत्यक्ष संक्रमण पढ़ाई के साथ पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण अध्ययन के परिणामों की तुलना देखा गया है, इन मेजबान प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स में कुछ उल्लेखनीय मतभेद 21 मनाया गया है। उदाहरण के लिए, मेजबान संकेतन और झिल्ली आधारित cytotoxicity में परिवर्तन भ्रष्टाचार से पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण मॉडल में घटित करने के लिए लंबे समय तक 30-50% लेप्रत्यक्ष संक्रमण मॉडल जवाब। क्योंकि पारगम्य झिल्ली डालने आधारित प्रणाली प्रत्येक के ऊपरी और निचले डिब्बों में अच्छी तरह से करने के लिए लागू किया जा करने के लिए माध्यम की आवश्यकता है, यहाँ वर्णित प्रणाली के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से विकसित की तुलना में प्रति इसी पहले से इस्तेमाल प्रत्यक्ष संक्रमण मॉडल के लिए कुल मध्यम मात्रा में एक 30% वृद्धि की आवश्यकता 21। कुल मध्यम मात्रा में यह अंतर, बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच वृद्धि की दूरी के साथ मिलकर जब सीधे संपर्क निषिद्ध है, संभावना समय एसएलएस मेजबान कोशिकाओं तक पहुँचने के लिए माध्यम के माध्यम से फैलाना और मनाया प्रभाव प्रकाश में लाना करने के लिए इसे लेता है बढ़ जाती है। इसके अतिरिक्त, पारगम्य झिल्ली डालने आधारित प्रणाली कई गैस विषैलापन कारक है कि कोशिका क्षति की मेजबानी के लिए योगदान करने की संभावना है निकालता है; इस प्रणाली में इन अतिरिक्त कारकों के अभाव भी मेजबान कोशिका मृत्यु और प्रत्यक्ष संक्रमण 21 की तुलना में मेजबान संकेत घटनाओं की दीक्षा में देरी के लिए योगदान करने की संभावना है। इन कारकों पर विचार किया जाना चाहिएजब प्रयोगों डिजाइनिंग अन्य secreted बैक्टीरियल घटकों का आकलन करने के लिए।
, मेजबान कोशिकाओं पर स्रावित बैक्टीरियल कारकों के प्रभाव का परीक्षण पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली के प्रत्येक आवेदन के लिए समय अंक की एक श्रृंखला के परीक्षण की सिफारिश की है के लिए सबसे सार्थक स्थितियों की पहचान करने के लिए। यह क्या शर्तों के हित के विशिष्ट विषैलापन कारक बेहतर (जैसे लॉग चरण, स्थिर चरण, कुछ पर्यावरण संकेतों के जवाब में, आदि) का उत्पादन किया है क्रम में सफलतापूर्वक अपने प्रभाव का पालन करने के तहत विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। मेजबान संकेत प्रोटीन में परिवर्तन के मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित प्रयोगों में, यह समय बताते हैं कि पर्याप्त समय एसएलएस मेजबान कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए और संकेतन बदलता 21 प्रेरित करने के लिए पर्याप्त मात्रा में उत्पादन किया जा करने के लिए अनुमति का चयन करने के लिए आवश्यक था। इसी समय, मेजबान संकेत की जरूरत में परिवर्तन का आकलन, एसएलएस प्रेरित झिल्ली permeabilization से पहले ही किया जा सकता इस आशय सी के रूप मेंविश्लेषण के लिए मेजबान सेल lysates के संग्रह omplicates। कोशिका मृत्यु एसएलएस से प्रेरित बेहतर सूचना दी संकेत घटनाओं में 21 की दीक्षा के बाद कई घंटे दोनों को प्रत्यक्ष और पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण मॉडल में मनाया जा सकता है। इसके अलावा, ब्याज की समय अंक के चयन में, यह भी महत्वपूर्ण है कि यह सुनिश्चित करने बैक्टीरिया अध्ययन किया जा रहा अध्ययन की अवधि के दौरान झरझरा डालने झिल्ली घुसना करने में असमर्थ हैं। एक विस्तारित अवधि में कुछ जीवाणु घटकों के उत्पादन झिल्ली की अखंडता को बाधित और कम डिब्बे के लिए बैक्टीरिया के पारित होने की अनुमति हो सकती है। क्या यह ब्याज की प्रणाली में एक संभावित समस्या है निर्धारित करने के लिए, जीवाणु उपभेदों अध्ययन किया जाना समय अंक की एक श्रृंखला में पारगम्य झिल्ली डालने आधारित प्रणाली के ऊपरी सदन के लिए लागू किया जा सकता है। हर समय बिंदु पर, सम्मिलित ध्यान से हटाया जा सकता है और नीचे कक्ष से मध्यम एकत्र की है और एक मानक कॉलोनी सह में उपयोग किया जा सकताunting परख (खंड 1.5 देखें)। कोई कालोनियों कम डिब्बे में सेल संस्कृति के माध्यम से बनते हैं, तो डालने झिल्ली को प्रभावी ढंग से समय बिंदु और बैक्टीरियल लोड परीक्षण किया पर बैक्टीरिया के पारित होने को रोकने माना जा सकता है।
एक और प्रयोगात्मक डिजाइन घटक है कि स्रावित बैक्टीरियल कारकों के प्रभावी विश्लेषण के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होने की संभावना है संक्रमण (MOI) की बहुलता है। MOI मेजबान सेल प्रति बैक्टीरियल कोशिकाओं के अनुपात को संदर्भित करता है, और इसलिए संक्रमण के समय में और बैक्टीरियल कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या (CFU) द्वारा मेजबान सेल confluency से प्रभावित है कोशिकाओं के लिए आवेदन किया। इन अध्ययनों में, keratinocyte कोशिकाओं 90% confluency, जो इन कोशिकाओं को बरकरार तंग जंक्शनों के साथ एक जोड़नेवाला monolayer फार्म करने की अनुमति के लिए बड़े हो रहे थे। मेजबान कोशिकाओं के शारीरिक संगठन के विचारशील विचार अध्ययन किया जा संक्रमण प्रयोगों के लिए एक उपयुक्त confluency का चयन करने के लिए आवश्यक है। एक बार एक approprमेजबान कोशिकाओं की देर हो गई संख्या प्रति अच्छी तरह से चुना गया है, एक उपयुक्त बैक्टीरियल CFU जा सकता गणना बंद वांछित MOI आधारित है। यहाँ वर्णित अध्ययनों में, गैस 10 उचित MOI के एक MOI में कोशिकाओं की मेजबानी के लिए अलग-अलग बैक्टीरिया के साथ और वांछित अनुवर्ती विश्लेषण के साथ अलग अलग होंगे लागू किया गया था। एक कम शुरुआत MOI आमतौर पर अधिक physiologically प्रासंगिक है और धीरे धीरे मेजबान सेल व्यवहार्यता में नाटकीय परिवर्तन से पहले मेजबान कोशिका संकेतन में सूक्ष्म परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त स्पष्ट कर रहे हैं जमा करने के लिए ब्याज की बैक्टीरियल कारक के लिए अनुमति देता है। उच्चतर MOIs cytotoxicity का आकलन कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन इस आशय भी एक कम MOI के साथ शुरुआत की है और संक्रमण के समय की एक लंबी अवधि के लिए प्रगति के लिए अनुमति देकर प्राप्त किया जा सकता है। यह ऑप्टिकल घनत्व परिणाम के लिए एक सटीक CFU का निर्धारण करने के लिए सभी जीवाणु उपभेदों परीक्षण किया जाना है, isogenic म्यूटेंट जंगली प्रकार के बैक्टीरिया की तुलना में एक बदल विकास दर हो सकती है के रूप में महत्वपूर्ण है और इसलिए है कि एक अधिक या कम CFU करने के लिए अच्छी तरह से प्रति जोड़ा जा आवश्यकता हो सकती हैप्रकारों के बीच मेजबान प्रतिक्रिया का एक उचित तुलना करता है। मामलों में जहां स्तनधारी मेजबान कोशिकाओं का अध्ययन किया जा रहा है जीवाणुओं को मारने या उनके विकास में बाधा या यदि जीवाणु उपभेदों के बीच nonsynchronous विकास शक किया जाता है, यह भी संक्रमण की अवधि के अंत में अंतिम बैक्टीरियल लोड आकलन करने के लिए अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता करने में सक्षम हैं। इस पारगम्य डालने की सामग्री को इकट्ठा करने और एक कॉलोनी गिनती परख प्रक्रिया की धारा 1.5 में वर्णित है कि इसी तरह के प्रदर्शन से पूरा किया जा सकता है।
वांछित परख के लिए उचित आकार कुओं का चयन भी इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। पारगम्य झिल्ली सम्मिलित आकार के एक किस्म में उपलब्ध हैं, लेकिन यहाँ दिखाया अध्ययन के लिए सबसे अच्छी तरह से अनुरूप परिणाम 24 और 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के लिए डिज़ाइन किया गया आवेषण का उपयोग कर मनाया गया। ये डालने के आकार अपेक्षाकृत बाँझ संदंश के साथ संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं, और हेरफेर की आसानी रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैअच्छी तरह से कम डिब्बे के लिए ऊपरी डिब्बे से बैक्टीरिया के अवांछित हस्तांतरण हैैं। मेजबान सेल lysates के संग्रह से जुड़े प्रयोगों के लिए, 6 अच्छी तरह से व्यंजन सबसे विश्लेषण के लिए शर्त के अनुसार एक उपयुक्त सेल नंबर प्रदान करते हैं और काफी बड़े नमूना संग्रह के लिए सेल स्क्रेपर्स समायोजित करने के लिए कर रहे हैं। Cytotoxicity assays जिसमें मेजबान कोशिकाओं पक्षपाती रहते हैं और एक फ्लोरोसेंट या colorometric डाई कि एक प्लेट रीडर पर मापा जा सकता है (जैसे ethidium homodimer परख, trypan नीले बहिष्कार परख) के साथ लेबल रहे हैं, इसी सम्मिलित करता है के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली का इस्तेमाल होता है की सिफारिश की। प्रयोगों में जो सेल संस्कृति के माध्यम से एकत्र की है और विश्लेषण किया जाएगा (जैसे LDH रिलीज, साइटोकाइन अध्ययन) के लिए या तो 24 में अच्छी तरह से या 6 अच्छी तरह प्लेटें, इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि छोटे कुओं आम तौर पर इन विश्लेषण के लिए पर्याप्त मात्रा में नमूना उपलब्ध कराने और आवश्यक का उपयोग कम से कम अभिकर्मकों। कुल मिलाकर, विधि बहुत बहुमुखी है और sampl तैयार करने की जरूरत अनुकूलित किया जा सकताकई अनुवर्ती अनुप्रयोगों के लिए तों।
The authors have nothing to disclose.
We thank our fellow Lee Lab colleagues, who provided valuable insight and expertise that greatly assisted this research. This work was supported by the Young Innovator Award from the National Institute of Health, awarded to S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty is supported by the Albertus Magnus Fellowship provided by Dr. Robert C. Boguslaski, and a teaching assistantship through the Eck Institute for Global Health at the University of Notre Dame.
Todd-Hewitt broth | Acumedia | 7161A | Use appropriate broth for bacterial species of interest. |
BioSpectrometer | Eppendorf | basic model | Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. |
Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Other brands are suitable. |
Agar | Sigma | A1296-1kg | Other brands are suitable. |
HaCaT human epithelial keratinocytes | Gift from lab of Victor Nizet. | ||
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | Use appropriate media for cell line of interest. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S162H | Use appropriate media additives for cell line of interest. |
10cm tissue culture dishes | Nunc | 150350 | Other brands are suitable. |
6 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7506 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
24 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7524 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
Glass coverslips | Fisherbrand | 12-541-B | These must be autoclaved prior to use for cell plating. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
Phenol Red Free DMEM | Life Technologies | 31053028 | Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay. |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
L-glutamine | Gibco | 25030149 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
Sodium pyruvate | Gibco | BP356100 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (6 well) | Corning | 3540 | |
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (24 well) | Corning | 3595 | |
Forceps | Fisher | 3120018 | These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts. |
Cell scrapers | Fisherbrand | 08-100-241 | These are only required for the collection of cell lysates. |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | TOXIC. This is only required for immunofluorescence imaging. |
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit | Pierce | 23227 | Other protein quantification assays may be used. |
Tris-glycine 4-15% polyacrylamide gels | BioRad | 4561083 | Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest. |
Electrophoresis cassette supplies | BioRad | 1658063 | Only required for Western Blotting. |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645050 | Only required for Western Blotting. |
Western blot transfer cassette | BioRad | Only required for Western Blotting. | |
Polyvinylidene (PVDF) Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | Only required for Western Blotting. |
Tween 20 | Sigma | P1379-500mL | |
Rabbit IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2030 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
Mouse IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2031 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
Phospho-p38 (T180+T182) MAPK antibody | Cell Signaling | 4511 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
Total p38 MAPK antibody | Cell Signaling | 8690 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor488 | Molecular Probes | A-11034 | Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection. |
LumiGLO Detection Reagent | KPL | 54-61-00 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
Detection film | Biodot | BDB57 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope | Nikon | Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses. | |
Normal goat serum | Thermo Scientific | 31873 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284-500mL | |
DAPI nuclear stain | Cell Signaling | 4083 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
Rhodamine-phalloidin actin stain | Molecular Probes | R415 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Only required for immunofluorescence imaging. |
Ethidium homodimer 1 | Molecular Probes | E1169 | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
Spectramax M5 Microplate Reader | Molecular Devices | Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable. | |
Saponin | Sigma | 47036-50G-F | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
Molecular Probes ATP Determination Kit | Life Technologies | A22066 | Other kits are likely to be suitable. |
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release | Roche | 11644793001 | Other kits are likely to be suitable. |
Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385-1L | Other suppliers are suitable. |
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420B | Other cocktails are likely to be suitable. |
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free | Sigma | S8830-2TAB | Other cocktails are likely to be suitable. |