Summary

Het ontwikkelen van een Speeksel Antibody Multiplex Immunoassay menselijke blootstelling aan Environmental Pathogens Meet

Published: September 12, 2016
doi:

Summary

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Abstract

De etiologie en de effecten van menselijke blootstelling aan omgevingsfactoren ziekteverwekkers zijn wereldwijd grote zorg, en dus zou de mogelijkheid om de blootstelling en infecties met behulp van kosteneffectieve, high-throughput benaderingen te beoordelen onontbeerlijk. Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling en analyse van een korrel-gebaseerde multiplex immunoassay mogelijkheid gelijktijdig de aanwezigheid van antilichamen in menselijk speeksel meerdere pathogenen. Speeksel is bijzonder aantrekkelijk in deze toepassing omdat het invasief, goedkoper en gemakkelijker te verzamelen dan serum. Antigenen van ziekteverwekkers uit de omgeving gekoppeld waarbij gecarboxyleerde microsferen (korrels) en gebruikt om antilichamen in zeer kleine volumes menselijke speekselmonsters met een kraal gebaseerde, oplossing-fase-assay gemeten. Bolletjes werden in combinatie met antigenen van Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirussen (G I.1 en G II.4) en hepatitis A-virus. Opdat de antigenen voldoende gekoppeld terde korrels, werd bevestigd middels koppelmiddelen soortspecifieke, dierlijke primaire invangantilichamen, gevolgd door incubatie met gebiotinyleerd anti-species secundaire detectie antilichamen en streptavidine-R-fycoerythrine reporter (SAPE). Als een controle voor het meten aspecifieke binding werd één kraal set identiek behandeld als de anderen behalve dat niet gekoppeld aan een antigeen. De antigeen gekoppelde en controle parels werden vervolgens geïncubeerd met prospectief verzamelde menselijke speekselmonsters, gemeten op een high throughput analyse gebaseerd op de principes van flowcytometrie, en de aanwezigheid van antilichamen tegen elk antigeen werd gemeten mediane fluorescentie- intensiteit eenheden (MFI) . Deze multiplex immunoassay heeft een aantal voordelen, waaronder meer gegevens met minder monster; lagere kosten en arbeid; en de mogelijkheid om de bepaling te passen aan verschillende doelen plaats. Resultaten geven aan dat de speekselklieren multiplex immunoassay kan identificeren eerdere blootstelling en infecties, wat kan worden especially nuttig in surveillance studies met grote menselijke bevolking.

Introduction

Achtentachtig procent van diarree gerelateerde ziekte wereldwijd wordt in verband gebracht met de blootstelling aan verontreinigde water, onveilig voedsel en slechte sanitaire / hygiëne, waardoor ongeveer 1,5 miljoen doden, van wie de meerderheid zijn kinderen 1. Dit is een belangrijke bron van zorg voor de openbare gezondheid van de ambtenaren en beleidsmakers. In een poging om blootstelling en ziekten die verband houden met water en andere milieu-pathogenen te onderzoeken, ontwikkelden we een multiplex immunoassay om antilichamen in menselijke monsters 2-4 te meten. Deze methode kan worden toegepast epidemiologische studies menselijke blootstelling aan deze pathogenen te bepalen en beter omlijnd en immunoprevalence incidente infecties.

Speeksel houdt aanzienlijke belofte als alternatief voor serum biomarker voor menselijk onderzoek. Onder de voordelen van speeksel zijn de niet-invasieve en gemak van monsterverzameling, lage kosten, en samples gemakkelijk worden opgehaald kinderen 5-7 </ Sup>. Serum- en speekselmonsters werden uitgebreid onderzocht op antilichamen tegen H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, hepatitis virussen A en C 13-14, noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, dengue virus 16, humaan immunodeficiëntievirus (HIV) 17 en Escherichia coli O157: H7 18.

Een multiplex immunoassay maakt de analyse van meerdere analyten tegelijk in één monstervolume binnen een enkele cyclus of lopen. Multiplexverzending antigenen van C. jejuni, T. gondii, H. pylori, werden hepatitis A virus, en twee noroviruses toegepast om menselijke speeksel IgG en IgA 2-4 3,4 en 2,3 plasma IgG antilichaamresponsen meten deze pathogenen met eenBead-based multiplexing immunoassay. Bij gebruik in combinatie met epidemiologische onderzoeken van blootstelling aan microben in water, bodem en voedsel, kan het type assay beschreven in deze studie waardevolle informatie voor het begrijpen van infecties veroorzaakt door ziekteverwekkers uit de omgeving te verruimen. Bovendien kan het speeksel antilichaam gegevens verkregen uit deze studies worden gebruikt om de risico-evaluatie modellen 19-22 te verbeteren.

Protocol

Goedkeuring werd verkregen van de Institutional Review Board (IRB # 08-1844, Universiteit van North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) voor het verzamelen van gestimuleerde crevicular speekselmonsters van strandgangers in Boquerón Beach, Puerto Rico, als onderdeel van de Verenigde Staten Environmental Protection Agency (US EPA) De nationale Epidemiologische en Environmental Assessment van recreatief (NEEAR) Water Study 23 tot zwemmen bijbehorende risico's en ziekten te beoordelen. Proefpersonen mits informe…

Representative Results

Een unieke kraal set werd gebruikt als een controle om niet-specifieke binding te meten en het monster van de variabiliteit proeven. Deze bolletjes werden identiek behandeld om het antigeen gekoppeld kralen met de uitzondering dat ze niet werden geïncubeerd met elk antigeen in de koppelingsstap. MFI-waarden> 500 verkregen uit de controle kralen geïncubeerd met alle speekselmonsters werden verwijderd uit verdere analyses vanwege vermoedelijke besmetting uit serum en de resterende rea…

Discussion

Deze resultaten geven aan dat de multiplex immunoassay werkwijze nuttig voor het onderscheiden tussen speekselmonsters die immunologisch of immunonegative zijn. Om immunopositivity te bepalen werd een cut-off point ontwikkeld door berekening van het gemiddelde plus drie standaardafwijkingen van de log-getransformeerde MFI reacties van de besturing gekoppelde parels getest met alle speekselmonsters. De cut-off point leverde de mogelijkheid van blootstelling en immunoprevalence beoordelen in een enkele of meerdere pathoge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.

Materials

Equipment and Software
Microcentrifuge Thermo Electron Corporation 75002446 Used to centrifuge samples
Vortex Mixer VWR G560 Used to mix samples
Sonicator (mini) Fisher Scientific 15-337-22 Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp Various
Hemacytometer (Bright Line) Housser Scientific  3200 Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold Millipore MSVMHTS00 Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker VWR 12620-926 Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) VWR 30128-346
Weighing Scale Mettler or other Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer Invitrogen 947-01 Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b) The MathWorks, Inc. Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014 Microsoft Corporation Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software Luminex Corporation LX200-XPON3.1 Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus : p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA  *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA  *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture Meridian Life Sciences 8505 Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori : lysate Meridian Life Sciences R14101 Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) Meridian Life Sciences R18426 Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni : heat killed whole cells KPL 50-92-93 Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus (CCHMC)* NA Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori KPL 01-93-94 Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii Abcam Ab23507 Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species KPL 01-92-93 Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson 705-065-149 Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) KPL 16-13-06 Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) KPL 16-18-06 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) KPL 176-1506 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ)  KPL 16-10-02 Used for Salivary Immunoassay
Consumables
1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes USA Scientific 1415-2500 Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µL pipette tip refills BioVentures 5030050C
200 µL pipette tip refills BioVentures 5030080C
1000 µL pipette tip refills BioVentures 5130140C
Aluminum foil Various Vendors Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates VWR 40002-009 Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates Millipore MABVN1250 Used to run assays
Oracol saliva collection system Malvern Medical Developments Limited Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads) Luminex Corporation Dependent on bead set Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) Pierce 77149 or 22980 Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Pierce 24510 Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) Molecular Probes S-866 Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) Sigma P-9416 Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, pH 7.4 Sigma P-3813 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA Sigma A-7888 0.1% (w/v)
Tween-20 Sigma P-9416 0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)** Sigma S-8032 **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma S-3139
5 N NaOH Fisher SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7.4 Sigma P-3688 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) Filter Sterilize and store at 4°C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) Sigma S-3139 0.1M NaH2PO4
5 N NaOH Fisher SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 Sigma P-3563 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

References

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. . Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. . Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C., Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
  29. . . Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).

Play Video

Cite This Article
Augustine, S. A. J., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K. D., Plunkett, T. R. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).

View Video