Im aktuellen Klima knapper Ressourcen entstehen neue Technologien, die es Forschern ermöglichen, Studien billiger, schneller und präziser durchzuführen. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines bead-basierten Speichel-Antikörper-Multiplex-Immunoassays zur gleichzeitigen Messung der Exposition des Menschen gegenüber mehreren Umweltpathogenen.
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Methodenartikel
eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Ätiologie und die Auswirkungen der Exposition des Menschen gegenüber Umwelt Erreger sind von großer Besorgnis weltweit und damit die Fähigkeit, Belichtung und Infektionen mit kostengünstige, High-Throughput-Ansätze unabdingbar wäre zu beurteilen. Diese Handschrift beschreibt die Entwicklung und Analyse eines bead-based multiplex Immunoassay Lage sind, die Anwesenheit von Antikörpern in menschlichen Speichel an mehrere Pathogene gleichzeitig messen. Saliva ist besonders attraktiv in dieser Anwendung, da sie nicht invasiv ist, billiger und leichter zu erfassen als Serum. Antigene aus Umweltpathogene wurden an carboxylierte Mikrokügelchen (Perlen) und verwendet, um Antikörper in sehr kleinen Volumina von menschlichen Speichelproben zu messen, eine Perlenbasis, Lösungsphasen-Assay. Die Perlen wurden in Verbindung mit Antigenen von Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Noroviren (G I.1 und G II.4) und Hepatitis - A - Virus. Um sicherzustellen, dass die Antigene wurden ausreichend gekoppeltdie Perlen, Kupplung wurde mit biotinyliertem Anti-Spezies Sekundär Nachweis-Antikörper und Streptavidin-R-Phycoerythrin Reporter (SAPE) unter Verwendung von artspezifischen, von Tieren stammenden primären Fänger-Antikörper, gefolgt von einer Inkubation bestätigt. Als Kontrolle nicht-spezifische Bindung zu messen, wurde ein Beadset identisch zu den anderen behandelt, außer es nicht an Antigen gekoppelt wurde. Die antigen-gekoppelt und Kontrollkügelchen wurden dann mit prospektiv gesammelten menschlichen Speichelproben inkubiert, auf einem Hochdurchsatz-Analysator auf den Prinzipien Durchflusszytometrie basierend gemessen von und die Anwesenheit von Antikörpern gegen jedes Antigen wurde in mittlere Fluoreszenzintensitätseinheiten (MFI), gemessen . Dieser Multiplex-Immunoassay hat eine Reihe von Vorteilen, mehr Daten mit weniger Probe enthält; reduzierte Kosten und Arbeit; und die Fähigkeit, den Test zu viele Ziele von Interesse anzupassen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Speichel Multiplex-Immunoassay-fähig sein kann vorherigen Belichtungen und Infektionen zu identifizieren, die especia sein kannlly nützlich in Beobachtungsstudien großen menschlichen Populationen beteiligt sind.
Einleitung
Eighty-acht Prozent der weltweiten Durchfall-Erkrankungen mit der Exposition des Menschen gegenüber kontaminierten Wasser, unsichere Lebensmittel und schlechte Hygiene / Hygiene verbunden ist, etwa 1,5 Millionen Menschen ums Leben kamen, die meisten davon sind 1 Kinder. Dies ist ein wichtiger Grund zur Besorgnis für Beamte des öffentlichen Gesundheitswesens und politische Entscheidungsträger. In dem Bemühen , mit wässrigen und anderen Umweltkrankheitserreger assoziiert Belichtungen und Krankheiten zu untersuchen, haben wir eine Multiplex - Immunoassay Antikörper in menschlichen Proben 2-4 zu messen. Dieses Verfahren kann auf epidemiologische Stu....
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Protokoll
Zustimmung wurde von der Institutional Review Board erhalten (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) für die Sammlung von stimulierter creviculare Speichelproben von beachgoers bei Boquerón Beach, Puerto Rico, als Teil der Vereinigten Staaten Environmental Protection Agency (US - EPA) Nationale Epidemiologische und die Umweltprüfung von Freizeit (Neear) Wasser Studie 23 zum Schwimmen im Zusammenhang Belichtungen und Krankheiten bewerten. Studienteilnehmer informierten Zustimmung zur Verfügung gestellt und wurden über die Verwendung der Speichelsammelvorrichtung durch geschultes USEPA Auftragnehmer angewiesen. Die Speichelproben ....
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Ergebnisse
Eine einzigartige Perle Set wurde als Kontrolle zur Messung der unspezifischen Bindung und Probe Variabilität zu probieren. Diese Kügelchen wurden identisch zu den Antigen gekoppelten Kügelchen mit der Ausnahme behandelt, daß sie nicht mit einem Antigen in der Kopplungsschritt inkubiert. MFI-Werte> 500 von den Kontrollkügelchen mit allen Speichelproben inkubiert erhalten wurden von der weiteren entfernt Analysen aufgrund vermuteter Kontamination von Serum und die restlichen Antworten .......
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Diskussion
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Multiplex-Immunoassay-Verfahren ist nützlich zum Unterscheiden zwischen Speichelproben, die immunopositive oder immunonegative sind. Um zu bestimmen, immunopositivity wurde durch Berechnung der Mittelwert plus drei Standardabweichungen der log transformierten MFI Reaktionen der Steuerung abgekoppelt Perlen eine einzige Grenzpunkt mit all den Speichelproben getestet entwickelt. Der Cut-off-Punkt die Fähigkeit zur Beurteilung der Belichtung und immunoprevalence entweder eine einzelne oder.......
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Offenlegungen
Die United States Environmental Protection Agency durch ihr Amt für Forschung und Entwicklung finanziert und verwaltet die Forschung hier beschrieben. Es hat sich Agentur administrative Überprüfung unterzogen und zur Veröffentlichung freigegeben. Die Erwähnung von Handelsnamen oder Handelsprodukten stellt keine Billigung oder Empfehlung für den Einsatz.
Danksagungen
Clarissa Curioso wurde durch eine Berufung in das Research Participation Program bei der U.S. Environmental Protection Agency unterstützt, das vom Oak Ridge Institute for Science and Education verwaltet wird, durch eine behördenübergreifende Vereinbarung zwischen dem U.S. Department of Energy und der U.S. EPA.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Equipment and Software | |||
| Mikrozentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Zum Zentrifugieren von Proben |
| Vortex-Mischer | VWR | G560 | Zum Mischen von Proben |
| Ultraschallgerät (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Zum Trennen von Kügelchen |
| Pipettiergeräte P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Verschiedene | |
| Hämazytometer (helle Linie) | Housser Scientific | 3200 | Wird zum Zählen von gekoppelten Kügelchen |
| verwendet Multiscreen-Vakuumverteiler | Millipore | MSVMHTS00 | Wird in Waschschritten verwendet, um Überstände zu entfernen |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Wird zum Rühren von Kügelchen während der Inkubation verwendet |
| Röhrchengestell (1,5 ml und 0,5 ml) (sortiert) | VWR | 30128-346 | |
| Waage | Mettler oder andere | Wird zur Messung von Waschreagenzien für die Herstellung von Puffern | |
| verwendet Dynabead Probenmischer | Invitrogen | 947-01 | Wird während des Kopplungs-Inkubationsschritts |
| verwendet MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Wird zur Analyse von Antikörper-Response-Daten | |
| verwendet Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Wird zur Analyse von Antikörper-Response-Daten | |
| Luminex Analyzer mit xPonent 3.1 Software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument und Software zum Ausführen von |
| assayAntigens | |||
| : p-Partikel | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Kinderkrankenhaus. Finale conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387: p-Partikel | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Finale conc. 5 µg. |
| Hepatitis-A-Virus: Konzentrat Grad II aus Zellkultur | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen gekoppelt bei 100 & Mikro; g |
| Helicobacter pylori: Lysat | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen gekoppelt bei 25 &; Mikro; g |
| Toxoplasma gondii: rekombinante p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen gekoppelt an 25 &; micro; g |
| Campylobacter jejuni: Hitze tötete ganze Zellen | KPL | 50-92-93 | Antigen gekoppelt bei 50 & Mikro; g |
| Primärantikörper | |||
| Meerschweinchen-Anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Wird zur Bestätigung der Kopplung |
| Anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | wird zur Bestätigung der Kopplung |
| Anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Wird zur Bestätigung der Kopplung |
| BacTraceAffinity Aufgereinigter Antikörper gegen Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Zur Kopplungsbestätigung |
| Ziegen-pAb an Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Zur Kopplungsbestätigung |
| BacTrace Ziege anti-CampylobacterSpezies | KPL | 01-92-93 | Zur Kopplungsbestätigung |
| Sekundär Antikörper | |||
| Donkey Anti-Ziegen-IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Zur Bestätigung der Kopplung |
| Biotinyliertes Kaninchen Anti-IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Zur Bestätigung der Kopplung |
| Biotinyliertes Kaninchen gegen IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Zur Bestätigung |
| der KopplungAffinitätsgereinigter Antikörper Biotin markierte Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) | KPL | 176-1506 | Wird zur Kopplung |
| Verbrauchsmaterialien1,5 | |||
| verwendet USA Scientific | 1415-2500 | Wird als niedrig bindende Mikrozentrifugenröhrchen | |
| 10 & Mikro verwendet; l Nachfüllungen für Pipettenspitzen | BioVentures | 5030050C | |
| 200 & micro; l Nachfüllungen mit Pipettenspitze | BioVentures | 5030080C | |
| 1.000 µ l Pipettenspitzen-Nachfüllungen | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminiumfolie | Verschiedene Anbieter | Verwendet Halten Sie Kügelchen während der Inkubation im Dunkeln | |
| Deep-Well-Platten | VWR | 40002-009 | Wird zum Verdünnen von Speichelproben verwendet |
| Multiscreen-Filterplatten | Millipore | MABVN1250 | Wird zur Durchführung von Assays verwendet |
| Oracol Speichelsammelsystem | Malvern Medical Developments Limited | Wird für die Speichelsammlung | |
| Reagenzien | |||
| Carboxylierte Mikrosphären (Kügelchen) | Luminex Corporation | Abhängig vom Bead-Set | Antigene sind an die Mikrosphären |
| gekoppelt EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid-Hydrochlorid) | Pierce | 77149 oder 22980 | Wird bei der Bead-Aktivierung |
| verwendetSulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimid) | Pierce | 24510 | Zur Verwendung bei der Bead-Aktivierung |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) | Molekulare Sonden | S-866 | Zur Verwendung als Reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure) | Sigma | M-2933 | Zur Kopplung |
| Tween-20 (Polyoxyethylenorbitanmonolaurat) | Sigma | P-9416 | Wird in Waschpuffern verwendet, um unspezifische Bindung |
| Proteinpuffer | |||
| PBS-TBN Blockierungs-/Lagerpuffer (PBS, 0,1 % BSA, 0,02 % Tween-20, 0,05 % Azid, pH 7,4) zu entfernen** | Filter Sterilisieren und lagern bei 4 μde; C | ||
| PBS, pH 7,4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl |
| BSA Sigma | A-7888 | 0,1 % (w/v) | |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0,2 % (v/v) |
| Natriumazid (0,05 % Azid)** | Sigma | S-8032 | **Vorsicht: Natriumazid ist akut toxisch. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. Tragen Sie geeignete PSA. Entsorgen Sie gemäß den geltenden Gesetzen. |
| MES/Coupling Buffer (0,05 M MES, pH 5,0) | |||
| MES (2-[N-Morpholinosulfonsäure) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Puffer (PBS, 1% BSA, pH 7,4) | Filter Sterilisieren und bei 4 ° C lagern; C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7,4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% BSA |
| Aktivierungspuffer (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2) | Filter Sterilisieren und lagern bei 4 Grad; C | ||
| NaH2PO4 (Natriumphosphat, monobasisch wasserfrei) | Sigma | S-3139 | 0,1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4) | Filter Sterilisieren und lagern bei 4 & Grad; C | ||
| PBS, 0,05 % Tween-20, pH 7,4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05 % TWEEN |
Referenzen
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
- Augustine, S., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
