Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.
Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.
Metylering av cytosin baser i DNA (5mC) representerer en stor epigenetisk merke finnes i virveldyr genomer forbundet med transkripsjonen tie 1. 5mC blir innført og vedlikeholdt av DNA metyltransferaser 2-5, og har vist seg å spille en viktig rolle i en rekke biologiske prosesser inkludert genomisk preging, X-kromosom inaktivering, cellulær differensiering og utvikling 3, 6. Følgelig avbrudd av 5mC genomiske mønstre er forbundet med en rekke sykdommer 7, 8-11. Til tross for fremgang i forståelsen 5mC rolle i utvikling og sykdom, er det fortsatt i stor grad ukjent hvordan dette merket blir fjernet i utvikling og voksne vev. Flere mulige mekanismer for DNA-demetylering har nylig blitt foreslått, inkludert aktive og passive demetylering mekanismer 12, 13, 14, 15. Oppdagelsen av produktene av 5mC sekvensiell oksydasjon mediert av 10-11 trans enzymes (tet1 / 2/3), slik som 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC), og 5-carboxylcytosine (5caC) i eukaryotisk DNA 16, 17, 18, 19 bedt spekulasjoner om de kan tjene som mellomprodukter ifølge DNA demetylering prosesser eller fungere som stabile epigenetiske merker i sin egen rett 13. Mens demonstrasjonen at komponenten base excision reparasjon, kan tymin-DNA glykosylase (TDG) binde og fjerne både 5FC og 5caC fra DNA 19, 20 antyder en rolle for de modifiserte 5mC derivater i et aktivt DNA demetylering. Nyere bevis som viser at 5FC / 5caC kan modulere frekvensen av RNA II processivity poeng til potensiell involvering av disse merkene i transkripsjonsregulering 29. På grunn av dette potensialet biologiske betydningen av oksiderte former for 5mC, har en rekke biokjemiske og antistoffbaserte teknikker vært ansatt for å studere deres genomisk distribusjon og globalt innhold 16, 19-24.
Gitt at det meste av than vertebrate organer bestå av forskjellige celletyper, og at fordelingen av modifiserte cytosin-baser er vev og celletype-spesifikk 16-18, 20, 23, 25-27, bestemme den romlige fordelingen av oksyderte 5mC derivater i forskjellige vev blir en viktig eksperimentell oppgave nødvendig for avsløring sine biologiske funksjoner. De fleste av de biokjemiske og antistoffbaserte tilnærminger gir ikke noen romlig informasjon angående fordelingen av de modifiserte former av 5mC i forskjellige vev og celletyper. I motsetning til dette, kan immunbaserte teknikker gir en hurtig verktøy for å vurdere den romlige fordelingen og nukleær lokalisering av 5mC 28 og sin oksyderte derivater 20. Det er sagt, rapporterte svært lav overflod av 5FC (20 i hver 10 6 cytosin) og 5caC (3 i hver 10 6 cytosin) i musegenomet 18 representerer en betydelig utfordring for standard immunkjemi.
Her,vi beskrive en svært følsom immunokjemisk metode som gir robust og en rask påvisning av oksidert form av cytosin i pattedyrs hjernevev. Ved å innlemme konjugert sekundære antistoffer kombinert med en signalforsterkning skritt, omgår denne metoden utfordringene i å detektere svært lave mengder 5FC og 5caC. I tillegg kan denne teknikken brukes til å co-oppdage de modifiserte former av cytosin med avstamning spesifikke markører, effektivt utfyller andre tilnærminger i å belyse de biologiske funksjonene til disse epigenetiske merker.
Selv om den rapporterte lave overflod av 5mC oksidasjons derivater, 5FC og 5caC i noen vev ville gi betydelige begrensninger for en standard immunkjemi protokoll, inkorporering av peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer tillot påvisning av disse cytosin modifikasjoner i faste vev og celler (Figur 2) . Imidlertid bør den optimale inkubasjonstiden med tyramide oppløsning optimaliseres eksperimentelt for hver enkelt gruppe av tyramide signalforsterkning sett hvor et lineært forhold mellom signalintensitet og varighet av tyramide basert signalforsterkning observeres, for detaljer, se Almeida et al. 2012 26 . I tillegg kan det signal / bakgrunnsforholdet bli betydelig forbedret ved å utføre de vaskinger i en Coplin krukke for å tillate effektiv fjernelse av overskytende antistoffer. Etter inkubering med tyramide løsning, er det viktig å umiddelbart stoppe reaksjonen ved å vaske i PBT oppløsning til decrease bakgrunnsfarging. Det er viktig ikke å la delene tørke ut på noe tidspunkt under prosedyren.
Effektiviteten av DNA depurinering kan forbedres ved å utføre depurinering reaksjonen ved 37 ° C. Mens ved anvendelse av 4 N HCI i stedet for 2-N forbedrer fargingen av de modifiserte former av 5mC ved hjelp av 4 N HCI for DNA depurinering ville ikke tillate samtidig farging med DAPI, som det samhandler utelukkende med dobbelt-trådet DNA.
Selv om denne teknikk kan gi robuste semi-kvantitativ vurdering av de modifiserte former av cytosin-baser hvor detekterbart, kan den ikke brukes til å evaluere de absolutte nivåene av 5mC eller dets oksidasjons derivater. Derfor anbefaler vi bruk av andre komplementære, men kvantitative tilnærminger 16, 19 -24. Siden oppdagelsen av 5mC oksidasjons derivater i pattedyr genomer, har flere metoder blitt utviklet for å studere deres biologiske roller 16, 19-24. Selv om disse approaches kan være verdifulle i å bestemme de absolutte nivåene av 5mC oksidasjon derivater, har de ikke gi informasjon om deres romlige fordelingen 20, 26. Vi har med hell brukt metoden beskrevet her for å kartlegge den romlige fordeling og lokalisering av 5mC oksidasjons derivater i ulike celletyper av utvikling og voksne hjernen 20
Ved å avdekke deres romlige fordeling 20, kan denne teknikken være avgjørende for forståelsen av de biologiske virkningene og skjebnen av oksyderte derivater av 5mC i forskjellige biologiske sammenhenger hvor disse modifiserte derivater av 5mC kan påvises inkludert cellulær differensiering, utvikling og sykdom. I tillegg kan fremgangsmåten beskrives her gi semi-kvantitative vurderinger av de oksyderte derivater av 5mC i forskjellige vev ved å bestemme kinetikken til peroksidase reaksjon (som er proporsjonal med fargeintensitet) på forskjellige inkubasjonstider med tyramide 26.
The authors have nothing to disclose.
We thank the Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) and the Histology team of MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), the Institute of Neuroscience at the ULB and the FNRS for help and support. This work was supported by MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.).
Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pPH 7.5, filtered before use |
4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50 % in PBS |
0.01 % Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | PH adjusted to 8.5 |
hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
22x32mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Colourless nail polish | |||
chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |