प्रजाति निर्धारण और मिश्रण में Quantitation मांस प्रमाणीकरण करने के लिए पेप्टाइड्स एप्लाइड के एमआरएम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग
Summary
We present a protocol for identifying and quantifying the components in mixtures of species possessing similar proteins. Mass spectrometry detects peptides for identification, and gives relative quantitation by ratios of peak areas. As a tool food for fraud detection, the method can detect 1% horse in beef.
Abstract
We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. Central to the method is the identification of ‘corresponding proteins’ in the species of interest, in other words proteins that are nominally the same but possess species-specific sequence differences. When subject to proteolysis, corresponding proteins will give rise to some peptides which are likewise similar but with species-specific variants. These are ‘corresponding peptides’. Species-specific peptides can be used as markers for species determination, while pairs of corresponding peptides permit relative quantitation of two species in a mixture. The peptides are detected using multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry, a highly specific technique that enables peptide-based species determination even in complex systems. In addition, the ratio of MRM peak areas deriving from corresponding peptides supports relative quantitation. Since corresponding proteins and peptides will, in the main, behave similarly in both processing and in experimental extraction and sample preparation, the relative quantitation should remain comparatively robust. In addition, this approach does not need the standards and calibrations required by absolute quantitation methods. The protocol is described in the context of red meats, which have convenient corresponding proteins in the form of their respective myoglobins. This application is relevant to food fraud detection: the method can detect 1% weight for weight of horse meat in beef. The corresponding protein, corresponding peptide (CPCP) relative quantitation using MRM peak area ratios gives good estimates of the weight for weight composition of a horse plus beef mixture.
Introduction
The European horse meat scandal of 2013, in which undeclared horse meat was found in a number of supermarket beef products1, highlights the need for testing methods capable of detecting and measuring food fraud in meat. Several technologies have been explored, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and DNA-based methods2. An alternative route, based on mass spectrometry, targets species-specific peptides which in turn arise from species-specific proteins. Here we outline one such peptide-based approach that offers both identification and relative quantitation of the adulterant species in a meat mixture3.
The protocol is framed in the context of red meats and the desire to determine the presence of one in another at the level of 1% by weight, the level considered by some to represent fraudulent food adulteration as opposed to contamination4. The method relies in the first instance on identifying a protein which is nominally ‘the same’ in all target meats. Myoglobin, the protein responsible for the red color of meat, is a good candidate since it is abundant, relatively heat tolerant and water soluble, and has been used for species determination of meat previously5,6. The myoglobins for beef (Bos Taurus), pork (Sus scrofa), horse (Equus caballus) and lamb (Ovis aries)3, for instance, are nominally the same, as required, but their sequences are not identical. Such groups of ‘similar but different’ proteins, like these four myoglobins, can conveniently be described as ‘corresponding proteins’. The sequence differences in these four myoglobins are species-specific: for example, the full myoglobin proteins for beef and horse, P02192 and P68082 respectively, each comprise 154 amino acids with 18 sequence differences between the two. Subject to proteolysis using trypsin these proteins produce two sets of peptides, some of which are identical, and some which show one or more species-specific amino acid differences: corresponding proteins therefore give rise to corresponding peptides.
The CPCP approach, therefore, seeks first to identify proteins from two or more species where these proteins exhibit limited species-specific sequence variants. These are corresponding proteins. Following proteolysis, corresponding proteins give rise to peptides, some of which likewise display species-specific sequence variants inherited from the parent protein. These are corresponding peptides. The CPCP approach can be used to compare levels of two corresponding proteins in a mixed species sample by monitoring the levels of corresponding peptides.
The natural technology for the detection of known peptides is multiple reaction monitoring mass spectrometry, or MRM-MS7. Species-specific peptides yield precursor ions, which along with their mass spectrometry fragment ions, are easily itemized in advance by software tools. These lists are then used to instruct the mass spectrometer to record only specific precursor plus fragment ion pairs, called transitions. A particular target peptide is therefore identified not only by its retention time in the chromatography preceding the mass spectrometer, but also by a set of transitions sharing a common precursor ion. This is a highly selective means of detecting known peptides that makes efficient use of the mass spectrometer resource.
Other authors have used mass spectrometry to test for meat adulteration via peptide markers but from disparate proteins8-14. Using the corresponding proteins, corresponding peptides (CPCP) scheme, however, means experimental conditions can be optimized, aiding identification of the species in the mixture from known species-specific transitions. In addition, corresponding proteins and peptides will generally behave similarly in the extraction, proteolysis and detection stages. Since transition peak areas are quantitative and reproducible, ratios of peak areas arising from pairs of corresponding peptides from different species provide a direct estimate of the relative quantities of two meats in a mixture. In contrast, more traditional quantitation routes exploit calibrations based on reference materials to establish absolute quantitation14,15.
Though the protocol is outlined in the context of myoglobin and meat, proteins other than myoglobin could be used for identification and relative quantitation via the CPCP strategy in meat mixtures, though potentially with modifications to the protocol. In addition the strategy is also applicable to binary mixtures of other species sharing one or more corresponding proteins.
The starting point for the protocol is purified ‘reference’ myoglobin, which for some species can be purchased but which for others must be prepared by conventional size-exclusion chromatography. The procedure for preparing reference myoglobin is not included in the protocol, but is described elsewhere3. Software tools16 are used to list candidate peptides and transitions arising from myoglobins of interest. Each reference myoglobin is subjected to proteolysis and the resultant peptides analyzed by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) to discover which of the candidate precursor ions and transitions are most useful, and to determine the matching peptide retention times. The outcome of this stage is a revised list of target peptides with their transitions, suitable for species determination, and a list of CPCP pairs, suitable for relative quantitation. To test real meats, sample extractions are prepared then subjected to proteolysis to generate peptides both from myoglobin and other extraneous proteins. The myoglobin-based peptides are then monitored by LC-ESI-MS/MS based on their listed transitions. The species present in a mixture are identified by the transition peaks associated with marker peptides. Estimates of the relative amounts of two meats in a binary mixture are calculated using ratios of transition peak areas. A set of test mixtures of pairs of meats will allow the ratio of peak areas for a given pair of transitions to be checked and calibrated against actual mixtures.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक उपयुक्त लक्ष्य प्रोटीन के चयन के लिए महत्वपूर्ण है। एक अच्छा लक्ष्य प्रोटीन ब्याज की प्रजातियों में इसी रूपों, पर्याप्त प्रजातियों पर निर्भर अनुक्रम भिन्नता, प्रजातियों विशिष्टता, है और जीवों के भीतर सुलभ मात्रा में मौजूद हैं की जरूरत है। मिश्रण है कि प्रसंस्करण आया है (उदाहरण के लिए, गर्मी उपचार) का आकलन करने के लिए, एक प्रोटीन एक दृश्य अपेक्षाकृत कि प्रसंस्करण के लिए प्रतिरक्षा होने वांछनीय है। Myoglobin पकाया लाल मांस सहित लाल मांस, के लिए एक अच्छे उम्मीदवार हैं, लेकिन केवल संभावना नहीं है। एक बार लक्ष्य प्रोटीन का फैसला किया है, प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा प्रोटीन प्रोटियोलिसिस है। एक प्रोटीन मायोग्लोबिन से अलग अच्छी तरह से एक विकल्प प्रोटियोलिसिस प्रोटोकॉल मांग कर सकते हैं।
प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित संदर्भ शुद्ध प्रोटीन के आधार पर एक खंड शामिल हैं। यह अवधारण समय खिड़कियां और उपयुक्त अग्रदूत और टुकड़ा आयनों की खोज करना है। इस खंड बहुत उपयोगी लेकिन जरूरी नहीं है।
<pवर्ग = "jove_content"> ब्याज की दो प्रजातियों से इसी पेप्टाइड जोड़े भी प्रयोग बिना सूचीबद्ध किया जा सकता है, यह कभी कभी मामला है कि एक दृश्य अंतर पाचन प्रोफ़ाइल पर नाटकीय परिणाम है। उदाहरण के लिए, पेप्टाइड जोड़ी VLGFHG (मांस) और ELGFQG (घोड़ा) एक विषम quantitation परिणाम (एक ढाल चित्रा 2 में कम से कम एक के रूप में प्रकट) दे। इसका कारण यह है उत्तरार्द्ध पेप्टाइड एक अपेक्षाकृत दबा KE दरार से पैदा होती है, इस मिश्रण में घोड़े के स्तर के एक के तहत अनुमान पैदा कर रहा है। विभिन्न अमीनो एसिड के साथ शुरू इसी पेप्टाइड्स इसलिए सबसे अच्छा परहेज कर रहे हैं। अक्सर दो इसी पेप्टाइड्स से टुकड़े समान एमिनो एसिड दृश्यों है और अच्छी तरह से व्यवहार कर रहे हैं, लेकिन यह हमेशा मामला नहीं है और विधि विकास के दौरान जाँच की जरूरत है। प्रजातियों की पहचान बहुत कम रिश्तेदार quantitation की तुलना में इन मुद्दों के प्रति संवेदनशील है।प्रोटोकॉल चार लाल मांस के लिए प्रदर्शन किया गया हैS 3। अतिरिक्त मांस प्रजातियों को शामिल किया जा सकता है, हालांकि संक्रमण शिखर आकार की गुणवत्ता, तो भी कई मार्कर पेप्टाइड्स सह Elute खराब हो सकता है, प्रभावी रूप से ध्यान केन्द्रित करना समय को कम करने और अंततः रिश्तेदार quantitation अनुमान अपमानजनक। सुधार इंस्ट्रूमेंटेशन, पहले से ही उपलब्ध है, इस में सुधार होगा। एक संबंधित मुद्दा नहीं है कि सभी मीट अलग myoglobins है। उदाहरण के लिए, घोड़ा, गधा और ज़ेबरा myoglobins समान हैं और इस तरह की सख्ती से विधि बोल रहा गोमांस में घोड़ा या गधा या ज़ेबरा का पता लगाने में ही सक्षम है। कुछ मामलों में, भले ही myoglobins समान नहीं हैं, कुछ प्रमुख पेप्टाइड्स हो सकता है। उदाहरण के लिए, कुछ भेड़ के बच्चे मायोग्लोबिन व्युत्पन्न मार्कर पेप्टाइड्स भी बकरी में दिखाई देते हैं।
एक जटिलता के इस और किसी भी अन्य प्रोटीन आधारित quantitation विधि सामना करना पड़ रहा है कि प्रोटीन के स्तर का सभी प्रजातियों भर में लगातार मान लिया जाना चाहिए या प्रोटीन पेप्टाइड का स्तर एक मिश्रण में मीट के स्तर पर तुच्छता समकक्ष करने के लिए कर रहे हैं है। मायोग्लोबिन और चार लाल मीटर के लिएखाती इस सार्वभौमिक सच नहीं है। सामान्य में स्तरों चार के निम्नतम स्तर का प्रदर्शन निर्भर प्रजातियों, सूअर का मांस के साथ हैं। इसके अलावा, मायोग्लोबिन स्तर मांस काटें और पशु उम्र के साथ बदलता रहता है। इसलिए हालांकि संक्रमण के शिखर क्षेत्रों के अनुपात की मायोग्लोबिन के अनुपात को मज़बूती से नक्शा, वास्तविक मीट के अनुपात के मानचित्रण के मिश्रण में मीट की संभावना स्रोतों के बारे में मान्यताओं पर एक अनुमान के ड्राइंग है।
दृष्टिकोण इस काम में उल्लिखित अन्य प्रकाशित योगदान से तरीकों की एक संख्या में अलग है। एक और अधिक विशिष्ट मार्ग प्रोटिओमिक तरीकों का उपयोग करने के लिए विभिन्न प्रजातियों में अलग-निर्भर मार्कर पेप्टाइड्स, जो मामले में अलग-अलग प्रजातियों के लिए मार्कर एक दूसरे 8-12,14,19 के साथ कोई विशेष संबंध के अधिकारी की पहचान है। इसके विपरीत, हम प्रजातियों पर निर्भर अनुक्रम वेरिएंट 3 अप करने के लिए ब्याज की सभी प्रजातियों के लिए आम प्रोटीन का चयन किया है। इसके अलावा हमारे रिश्तेदार quantitation रणनीति के लिए केंद्रीय जा रहा है, यह लाभ है कि नमूना हैतैयारी रणनीतियों अनुकूलित किया जा सकता। इसके अलावा, इस तरह के इसी प्रोटीन इसी तरह व्यवहार करने के लिए, उदाहरण के लिए, निकासी में या इस तरह खाना पकाने या डिब्बाबंदी के रूप में नमूने के वाणिज्यिक प्रसंस्करण में उम्मीद की जा सकती है। प्रजातियों की पहचान तो आम तौर पर, असमान मार्कर पेप्टाइड्स का पता लगाने के माध्यम से आय आमतौर पर एक या दो अनुक्रम मतभेद रखने निकट से संबंधित पेप्टाइड का पता लगाने के माध्यम से CPCP दृष्टिकोण प्रजातियों की पहचान आय में जबकि। अंत में, प्रोटीन के quantitation किसी अन्य रूप में एक प्रजाति के वजन से प्रतिशत अनुमान लगाने के लिए पारंपरिक प्रत्येक प्रोटीन को अलग से जाना जाता मानकों के आधार पर 7,14,15 का पूर्ण quantitation के माध्यम से आगे बढ़ना हो सकता है। हालांकि CPCP विधि अंशांकन तरीकों के लिए कोई जरूरत नहीं है का उपयोग कर। इसके बजाय, रिश्तेदार का स्तर, दो प्रजातियों से दो इसी पेप्टाइड्स के संकेत ताकत की तुलना पूर्ण माप मंच को पूरी तरह दरकिनार करके अनुमान है। चूंकि अंतिम लक्ष्य Ano में एक प्रजाति के वजन से एक प्रतिशत हैवहाँ एक रिश्तेदार quantitation, तो CPCP दोनों अधिक प्रत्यक्ष और दो पूर्ण quantitation माप की तुलना की तुलना में आसान है। इन सुविधाओं को कम प्रयोगात्मक बार, लगभग दो घंटा के परिष्कृत प्रोटोकॉल का उपयोग होना पूर्वानुमानित में अनुवाद, तकनीक खाद्य धोखाधड़ी का पता लगाने के दायरे में एक तेजी से निगरानी उपकरण के रूप में उपयोगी बना रही है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge financial support from Institute of Food research BBSRC Core Strategic Grant funds, BBSRC Project BB/J004545/1.
Materials
| Uniprot database | www.uniprot.org | Freely accessible database of protein sequences | |
| Skyline software | www.skyline.gs.washington.edu | Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | O9830 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10674922 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10010010 | |
| Urea | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | U5378 | |
| Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | T1426 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | F0507 | |
| Coomassie Plus Protein Assay Reagent | Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com | 1856210 | |
| Protein standard | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | P0914 | |
| Ultra Turrax homogeniser T25 | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 13190693 | |
| Edmund and Buhler KS10 lab shaker | |||
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com | 75002420 | |
| Vacuum centrifuge RC 1022 | Jouan | ||
| Plate Reader | |||
| Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes | Phenomenex, Macclesfield, UK | 8B-S100-UBJ | |
| 4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | ||
| 1200 rapid resolution LC system | Agilent, Stockport, UK | ||
| XB C18 reversed-phase capillary column (100 x 2.1mm, 2.6µ particle size) | Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com | ||
| Analyst 1.6.2 software | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration | |
| Autosampler vials |
References
- O’Mahony, P. J. Finding horse meat in beef products-a global problem. QJM-An Int. J. Med. 106, 595-597 (2013).
- Sentandreu, M. A., Sentandreu, E. Authenticity of meat products: Tools against fraud. Food Res. Int. 60, 19-29 (2014).
- Watson, A. D., Gunning, Y., Rigby, N. M., Philo, M., Kemsley, E. K. Meat Authentication via Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry of Myoglobin Peptides. Anal. Chem. 87, 10315-10322 (2015).
- Food Standards Agency. . Report of the investigation by the Food Standards Agency into incidents of adulteration of comminuted beef products with horse meat and DNA. , (2013).
- Taylor, A. J., Linforth, R., Weir, O., Hutton, T., Green, B. Potential of electrospray mass-spectrometry for meat pigment identification. Meat Science. 33, 75-83 (1993).
- Ponce-Alquicira, E., Taylor, A. J. Extraction and ESI-CID-MS/MS analysis of myoglobins from different meat species. Food Chem. 69, 81-86 (2000).
- Gallien, S., Duriez, E., Domon, B. Selected reaction monitoring applied to proteomics. J. Mass Spectrom. 46, 298-312 (2011).
- Orduna, A. R., Husby, E., Yang, C. T., Ghosh, D., Beaudry, F. Assessment of meat authenticity using bioinformatics, targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1709-1717 (2015).
- Claydon, A. J., Grundy, H. H., Charlton, A. J., Romero, M. R. Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1718-1729 (2015).
- von Bargen, C., Brockmeyer, J., Humpf, H. U. Meat Authentication: A New HPLC-MS/MS Based Method for the Fast and Sensitive Detection of Horse and Pork in Highly Processed Food. J. Agric. Food Chem. 62, 9428-9435 (2014).
- von Bargen, C., Dojahn, J., Waidelich, D., Humpf, H. U., Brockmeyer, J. New Sensitive High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Horse and Pork in Halal Beef. J. Agric. Food Chem. 61, 11986-11994 (2013).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry. Food Chem. 187, 297-304 (2015).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid detection of Peptide markers for authentication purposes in raw and cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
- Sentandreu, M. A., Fraser, P. D., Halket, J., Patel, R., Bramley, P. M. A Proteomic-Based Approach for Detection of Chicken in Meat Mixes. J. Proteome Res. 9, 3374-3383 (2010).
- Elliott, M. H., Smith, D. S., Parker, C. E., Borchers, C. Current trends in quantitative proteomics. J. Mass Spectrom. 44, 1637-1660 (2009).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Keeton, J. T., Ellerbeck, S. M., Nunez de Gonzalez, M. T., Devine, C., Dikeman, M. . Encyclopedia of Meat Sciences. 1, 235-243 (2014).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid Detection of Peptide Markers for Authentication Purposes in Raw and Cooked Meat Using Ambient Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
