एक साँस बूंद हेरफेर मंच पर मल्टी nucleotide बहुरूपताओं के दृश्य वर्णमिति जांच
Summary
यह काम एक साँस छोटी बूंद हेरफेर मंच पर बहु nucleotide बहुरूपताओं पता लगाने के लिए एक सरल और दृश्य विधि प्रस्तुत करता है। प्रस्तावित विधि, पूरे प्रयोग, छोटी बूंद हेरफेर और बहु nucleotide बहुरूपताओं का पता लगाने सहित के साथ, उन्नत उपकरणों की सहायता के बिना 23 डिग्री सेल्सियस के पास प्रदर्शन किया जा सकता है।
Abstract
बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एमएनपी) का पता लगाने के लिए एक सरल और दृश्य विधि एक खुली सतह पर एक साँस छोटी बूंद हेरफेर मंच पर प्रदर्शन किया गया था। वर्णमिति डीएनए का पता लगाने के लिए यह दृष्टिकोण सोने nanoparticle जांच (AuNP जांच) के संकरण की मध्यस्थता विकास पर आधारित था। विकास आकार और AuNP के विन्यास जांच के साथ संकरित डीएनए नमूनों की संख्या का प्रभुत्व है। नैनोकणों के विशिष्ट आकार- और आकार पर निर्भर ऑप्टिकल गुणों के आधार पर, जांच के लिए एक नमूना डीएनए टुकड़ा में बेमेल की संख्या भेदभाव किया जा करने में सक्षम है। परीक्षण क्रमश अभिकर्मकों और डीएनए नमूने युक्त बूंदों के माध्यम से आयोजित किया गया था, और ले जाया गया और लचीला PDMS आधारित superhydrophobic झिल्ली की नियंत्रित वायवीय सक्शन साथ वायवीय मंच पर मिलाया। बूंदों कि कोई साइड eff के साथ अत्यधिक biocompatible है प्रस्तावित वायवीय मंच पर एक खुली सतह पर एक साथ और ठीक दिया जा सकता हैबूंदों के अंदर डीएनए नमूनों की ect। दो प्रस्तावित तरीकों के संयोजन, बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता वायवीय छोटी बूंद हेरफेर मंच पर नजर में पता लगाया जा सकता है; कोई अतिरिक्त साधन की आवश्यकता है। अंतिम परिणाम के लिए मंच पर स्थापित करने से बूंदों प्रक्रिया कम से कम 5 मिनट, मौजूदा तरीकों के साथ तुलना में काफी कम समय लगता है। इसके अलावा, इस संयुक्त एमएनपी पता लगाने के दृष्टिकोण प्रत्येक आपरेशन, जो एक मैक्रो प्रणाली की तुलना में उल्लेखनीय कम है में केवल 10 μl का एक नमूना मात्रा की आवश्यकता है।
Introduction
एकल nucleotide बहुरूपता (एसएनपी) है, जो एक डीएनए अनुक्रम में एक एकल आधार जोड़ी अंतर है, सबसे आम आनुवंशिक रूपों में से एक है। वर्तमान अध्ययन की रिपोर्ट है कि SNPs रोग के जोखिम, दवा प्रभावकारिता और जीन समारोह को प्रभावित करने से व्यक्तियों के साइड इफेक्ट के साथ जुड़े रहे हैं। 1,2 हाल के अध्ययनों से यह भी पता चला है कि दो या बहु बिंदु उत्परिवर्तन (बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता) विशेष रूप से रोगों और व्यक्ति का कारण 3,4 न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता का पता लगाने के रोग के प्रभाव में मतभेद। इसलिए रोग prescreening में जरूरी है। अनुक्रम विशिष्ट ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स का तेजी से पता लगाने के लिए सरल और कुशल तरीके अत्यधिक पिछले दो दशकों में विकसित किया गया। डीएनए उत्परिवर्तन जांच स्थिरीकरण, प्रतिदीप्ति लेबलिंग, जेल वैद्युतकणसंचलन, आदि सहित प्रक्रियाओं की पहचान आम तौर पर शामिल करने के लिए 1,5 वर्तमान दृष्टिकोण, 6,7 लेकिन उन तरीकों को आम तौर पर एक लंबी प्रक्रिया विश्लेषणात्मक, expen की आवश्यकता होती हैनिर्णायक उपकरण, अच्छी तरह से प्रशिक्षित तकनीशियन, और नमूने और अभिकर्मकों के महत्वपूर्ण खपत।
मात्रा और अद्वितीय भौतिक गुणों के लिए सतह क्षेत्र का एक बड़ा अनुपात के साथ एक nanoparticle विशिष्ट बायोमार्कर के लिए एक बेहद संवेदनशील और सस्ते का पता लगाने के मंच के रूप में एक आदर्श सामग्री है। सोने के नैनोकणों (AuNP) व्यापक रूप से, क्योंकि उनके महान क्षमता के डीएनए का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है oligonucleotide जांच के साथ संशोधित किया जाना है। 8-10 एसएनपी पता लगाने की तकनीक भी AuNP का उपयोग कर विकसित किया गया। 11-13 इस काम में हम पता लगाने के लिए एक उपन्यास वर्णमिति दृष्टिकोण अपनाया बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एमएनपी) के माध्यम से AuNP जांच के लिए डीएनए संकरण की मध्यस्थता वृद्धि हुई है। 14 यह सरल और तेजी से जांच कर रही विधि के सिद्धांत पर आधारित है कि एकल असहाय डीएनए (ssDNA) या डबल असहाय डीएनए (dsDNA) संयुग्मित के विभिन्न लंबाई AuNP विकास आकार और AuNP के आकार को प्रभावित करती है (चित्रा 1 देखें)। 15 डीएनए का पता लगाने का यह तरीकाअभिकर्मकों का एक छोटा सा की खपत, एक छोटे से परख अवधि (कुछ ही मिनट), और थर्मल नियंत्रण के बिना एक साधारण प्रक्रिया है कि नैदानिक निदान और घरेलू चिकित्सा जांच के लिए भावी लागू है सुविधाएँ।
डीएनए अनुक्रम का पता लगाने के लिए कई microfluidic सिस्टम विकसित किया गया है, 16 उन microfluidic प्रणाली, पारंपरिक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल से विकसित किया है, बड़े पैमाने पर उपकरणों की कम टुकड़े की आवश्यकता है और सरलीकृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के रूप में तो डीएनए की संवेदनशीलता, सीमा का पता लगाने और विशिष्टता सुधार करने के लिए biosensor। Microfluidic प्रणालियों में डीएनए का पता लगाने के तरीकों अभी भी एक एकल readout विषम एसएनपी की पहचान करने के लिए आवश्यकता होती है, हालांकि, संकेत प्रवर्धन और एक प्रतिदीप्ति पाठक के लिए इस तरह के एक पीसीआर (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन) के रूप में बाद में एक प्रक्रिया के उपकरणों मशीन। 17,18 एक सरल का विकास बाद के प्रसंस्करण के बिना मंच सीधे बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता के परिणामों को बाहर पढ़ने के लिएअति आवश्यक है। की तुलना में अच्छी तरह से इस्तेमाल करने के लिए, पारंपरिक, microfluidic प्रणालियों को बंद कर दिया, खुले सतह microfluidic उपकरणों आशाप्रद इस तरह के एक स्पष्ट ऑप्टिकल पथ, नमूना का उपयोग करने के लिए एक आसान तरीका है, एक प्रत्यक्ष पर्यावरण पहुंच और कोई आसानी से गठित cavitation या इंटरफेसियल बाधा के रूप में कई लाभ प्रदान करते हैं चैनल। 19 हमारे पिछले काम खुले सतह छोटी बूंद हेरफेर (चित्रा 2 देखें)। 20 के लिए एक सरल साँस मंच की शुरुआत की इस मंच, बूंदों को एक साथ ले जाया जा सकता है और एक चूषण बल का उपयोग कर एक ड्राइविंग ऊर्जा से हस्तक्षेप के बिना चालाकी पर है, जो एक है जैविक और रासायनिक अनुप्रयोगों में काफी संभावना। इस वायवीय मंच इस प्रकार AuNP जांच के लिए डीएनए संकरण की मध्यस्थता विकास की अवधारणा का उपयोग वर्णमिति दृष्टिकोण के साथ संयोजन में एमएनपी का पता लगाने के लिए डीएनए नमूनों के हेरफेर पर अमल करने के लिए उपयोग किया गया था।
इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का वर्णनएक साधारण दृश्य एक खुले सतह पर वायवीय छोटी बूंद हेरफेर मंच पर बहु nucleotide बहुरूपताओं का पता लगाने। इस काम की पुष्टि करता है कि बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता नग्न आंखों से detectable है; प्रस्तावित वायवीय मंच जैविक और रासायनिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, एक सरल विधि वर्णमिति पता लगाने के लिए एमएनपी 0.11-0.50 सुक्ष्ममापी से microcentrifuge ट्यूब में लेकर सांद्रता में लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रस्तावित एमएनपी का पता लगाने विधि डीएनए जांच और अ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.
Materials
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5 -end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
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