Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.
Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.
Retinoic एसिड (आरए) retinol या विटामिन ए की एक मेटाबोलाइट व्युत्पन्न है और कई सेलुलर डीहाइड्रोजनेज 1 के अनुक्रमिक गतिविधि के माध्यम से उत्पादन किया है। इसकी amphiphatic रासायनिक प्रकृति के कारण, यह आसानी से लिपिड झिल्ली पार और एक घुलनशील मॉर्फ़ोजेनेटिक कारक 1 के रूप में कार्य कर सकते हैं। यह एक आवश्यक अणु है कि परमाणु retinoid रिसेप्टर्स के लिए एक ligand के रूप में अभिनय और जीन अभिव्यक्ति 2-10 सक्रिय द्वारा कई विकासात्मक और वयस्क सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है। आरए के बिना, इन आरए रिसेप्टर्स (RARs) डीएनए और repressors के रूप में कार्य में बाँध rares; आरए इन रिसेप्टर्स के लिए बाध्य उन्हें ट्रांसक्रिप्शनल लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति 1,5,6 में जिसके परिणामस्वरूप activators में बदल जाता है।
हालांकि आरए संकेतन मार्ग में अच्छी तरह से पहचाना जाता है, छोटे आकार (~ 300 दा) और रा के amphipathic प्रकृति प्रत्यक्ष ऊतकीय दृश्य और वर्तमान में आरए की माप तकनीकी रूप से अव्यावहारिक 11 में आता है। दीर के लिए एकमात्र तरीकाआरए के स्तर की माप ect उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) 11 का उपयोग ऊतकों के नमूनों से Ra के अलगाव के माध्यम से होता है। यह प्रक्रिया आम तौर विभिन्न नमूनों 12 पूलिंग द्वारा सुविधा के ऊतकों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है। इस प्रकार, इस तकनीक खराब व्यक्तिगत भ्रूण या नमूना / ऊतक की छोटी मात्रा में आरए स्तर की माप के लिए अनुकूल है।
आदेश आरए के सेलुलर समारोह की जांच करने के लिए, कई तरीकों का परोक्ष रूप से आरए की उपस्थिति अनुमान करने के लिए विकसित किया गया है। इन विधियों संवाददाता दुर्लभ अत्यधिक संवेदनशील RAR-बीटा बीटा galactosidase या luciferase 11,13,14 की अभिव्यक्ति ड्राइविंग युक्त सिस्टम का इस्तेमाल करते हैं। ट्रांसजेनिक दुर्लभ lacZ रिपोर्टर रोसंट एट अल। 13 से उत्पन्न माउस सीटू 11,13,15,16 में आरए सिगनल के spatiotemporal क्षेत्रों visualizing के लिए एक आदर्श व्यवस्था है लेकिन मात्रात्मक मापन के लिए अनुपयुक्त है। F9 दुर्लभ lacZ सेल लाइन 14, टी परवह दूसरी ओर, ऊतक explants 11,12,14,17,18 में आरए और आरए स्तरों के मात्रात्मक मापन का पता लगाने के लिए उपयोगी है।
F9 teratocarcinoma कोशिकाओं, अंतर्जात अल्फा बीटा व्यक्त करते हैं, और गामा-retinoic एसिड रिसेप्टर्स 19, और आरए 19-21 से संपर्क के बाद पार्श्विका एण्डोडर्म में भेदभाव आरंभ करें। F9 कोशिकाओं लंबे आरए प्रेरित सेलुलर भेदभाव के लिए एक मॉडल है, यही वजह है कि यह एक आरए संवाददाता परख के लिए एक आदर्श सेल लाइन के रूप में चुना गया था के रूप में स्थापित किया गया है। F9 व्युत्पन्न एसआईएल-15 आरए संवाददाता सेल। वैगनर एट अल द्वारा उत्पन्न लाइन 14 एक ई होता है coli'LacZ जीन 64-बीपी retinoic एसिड प्रतिक्रिया तत्व मानव बीटा retinoic एसिड रिसेप्टर (RAR-बीटा) जीन की (दुर्लभ) की एक प्रति के बहाव। आदेश का चयन और स्थिर क्लोन बनाए रखने के लिए, निर्माण भी G418 की उपस्थिति में एक चयन मार्कर के रूप में अमिनोग्लाईकोसाइड phosphotransferase (NEO आर) जीन होता है। इस का निर्माण सहआरए की उपस्थिति है, जो lacZ धुंधला के माध्यम से देखे जा सकते हैं में बी-galactosidase की inducible अभिव्यक्ति nfers और इस प्रतिक्रिया के बाद हो सकता है वर्णमिति तरीकों 11,12,14,18 का उपयोग मात्रा।
यह अत्यंत बहुमुखी संवाददाता सेल लाइन व्यापक रूप से इस तरह के कर्णावत 17 और भ्रूण मंजिल प्लेट explants 14 के रूप में संवाददाता कोशिकाओं, ऊतकों के नमूनों के साथ सह-संस्कृति के माध्यम से अंतर्जात आरए उत्पादन का पता लगाने में इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, इस संवाददाता लाइन अलग से भ्रूण रीढ़ की हड्डी डोरियों की जमा वर्गों संवर्धन और F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं 18 करने के लिए इन संस्कृतियों से वातानुकूलित मीडिया जोड़कर विकासशील रीढ़ की हड्डी में आरए स्तर की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया है। मात्रा का ठहराव एक मानक एलिसा प्लेट रीडर का उपयोग कर 11,12,18 वर्णमिति पढ़ने के माध्यम से lacZ धुंधला के बाद किया गया था। अन्त में, इस संवाददाता सेल लाइन monitori द्वारा आरए चयापचय एंजाइमों की उपस्थिति का पता लगाने में इस्तेमाल किया गया हैएनजी आरए स्तरों 12,18 में बदल जाता है।
यहाँ हम रिपोर्ट है कि इस संवाददाता सेल लाइन की संवेदनशीलता भी व्यक्ति सह सुसंस्कृत E8.5 भ्रूण से उत्पन्न आरए के स्तर की माप के लिए अनुमति देता है। यह अलग जीनोटाइप के व्यक्तिगत भ्रूण के बीच तुलना में सक्षम बनाता है। एक विशिष्ट उदाहरण के रूप में, Gpr161 एक अनाथ GPCR कि आरए संकेतन मार्ग 22 के माध्यम से हिस्से में neurulation को नियंत्रित करता है, और हम में समग्र आरए स्तरों पर Gpr161 (Gpr161 वीएल) में एक अप्रभावी उत्परिवर्तन के प्रभाव की जांच करने के लिए इस संवाददाता सेल लाइन का उपयोग कर रिपोर्ट भ्रूण। इस के अलावा, बहुमुखी प्रतिभा और आसानी से उपयोग इस संवाददाता प्रणाली की स्वतंत्रता को मापने और, विभिन्न ऊतकों के नमूनों में आरए स्तर की तुलना वयस्क रीढ़ की हड्डी की स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त neurosphere संस्कृतियों में भी करने की अनुमति देता है। यहाँ हम F9 दुर्लभ lacZ आरए प्रतिनिधि के साथ प्रत्यक्ष सह संस्कृति के माध्यम से भ्रूण और neurosphere संस्कृतियों में रिश्तेदार आरए स्तर की मात्रात्मक निर्धारण का वर्णनorter सेल लाइन।
F9 दुर्लभ lacZ सेल लाइन 14 एक शक्तिशाली प्रणाली है कि आरए का पता लगाने के ऊतक explants 12,14,17,18 द्वारा उत्पादित के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह 100 एफएम के रूप में के रूप में कम आरए सांद्रता के प्रति संवेदनशील है, कोई गैर विशिष्ट प्रतिक्रिया आरए 12,14,18 के साथ इलाज कोशिकाओं में पाया के साथ। इसके अलावा, संवाददाता कोशिकाओं एकाग्रता की एक विशिष्ट श्रेणी के भीतर एक रेखीय ढंग से सब पार आरए का जवाब है, इस प्रकार की अनुमति lacZ प्रतिक्रिया मात्रा निर्धारित और आरए स्तरों 12,14,18 की भयावहता को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। त्वरित और आसान आरए संवाददाता यहाँ प्रस्तुत परख भ्रूण और सुसंस्कृत वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के दृश्य (चित्रा 2) और रिश्तेदार मात्रात्मक माप (चित्रा 3) के लिए F9 दुर्लभ lacZ संवाददाता सेल लाइन का इस्तेमाल करता है। इस संवाददाता प्रणाली व्यक्तिगत नमूनों के बीच अंतर्जात आरए स्तर, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है की तुलना की अनुमति देता है। यह काफी संवेदनशील आरए पता लगाने के लिए सक्षम हो जाता हैव्यक्तिगत E8.5 भ्रूण (2A चित्रा) के साथ-साथ आरए सुसंस्कृत neurospheres (चित्रा 2 बी) द्वारा उत्पादित द्वारा उत्पन्न। आरए की सांद्रता अलग-अलग करने के लिए इस सेल लाइन की खुराक पर निर्भर प्रतिक्रिया के नमूने (चित्रा 3 बी) के बीच नमूनों में आरए स्तर (चित्रा 3 ए) की मात्रा का ठहराव के साथ ही रिश्तेदार आरए के स्तर की तुलना करने के लिए अनुमति देता है। ऐसा नहीं है कि F9 दुर्लभ संवाददाता सेल लाइन आरए की कुल राशि ऊष्मायन के समय के साथ ऊतक के नमूने से उत्पन्न उपायों नोट करना महत्वपूर्ण है। इस आरए संश्लेषण और अपचय का शुद्ध संतुलन के बराबर है।
जबकि F9 दुर्लभ lacZ सेल संवाददाता प्रणाली अत्यधिक संवेदनशील और बहुमुखी है, वहाँ कई महत्वपूर्ण समस्या निवारण चरणों कि हम इस प्रणाली की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने में शामिल हो रहे हैं। पहला, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, यह महत्वपूर्ण है उन्हें जी की अनुमति के बिना नियमित मार्ग से इन कोशिकाओं के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए हैconfluency करने के लिए पंक्ति। दूसरा, हमने देखा है बाद में मार्ग असंगत आरए प्रतिक्रियाओं में परिणाम देते हैं, भले ही संस्कृतियों लगातार G418 के साथ चयन के तहत रखा जाता है। इस समस्या के निवारण के लिए, यह 20 मार्ग के बाद संस्कृतियों त्यागने और एक नई शीशी पिघलना करने के लिए सिफारिश की है। इसके अलावा, नियमित जांच सुनिश्चित करने के लिए कि रिपोर्टर कोशिकाओं को अभी भी मीडिया में आरए की उपस्थिति को मजबूत responders हैं प्रदर्शन किया जाना चाहिए। तीसरा, जल्दी मार्ग आरए (चित्रा 1 बी, बाएं), एक या subcloning के कई दौर के लिए गरीब या गैर वर्दी प्रतिक्रिया प्रदर्शित यदि आवश्यक हो सकता है जब तक मजबूत responders (चित्रा 1 बी, righ टी) प्राप्त कर रहे हैं। अन्त में, सह संस्कृति करने से पहले, यह सिफारिश की है कि इस तरह के भ्रूण और neurospheres के रूप में ऊतकों के नमूनों एकल कक्षों को अलग कर रहे हैं। हम और अधिक सुसंगत वर्णमिति माप में नमूने के परिणाम की कि हदबंदी मनाया गया है। यह एक और भी संस्कृति कुओं में आरए के वितरण के कारण हो सकता है, के रूप में अलग कोशिकाओं यूनी में हैंसंवाददाता कोशिकाओं के साथ फार्म से संपर्क करें।
कई संशोधनों के भी मूल प्रोटोकॉल 14 में किए गए थे। सबसे पहले, F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं की आरए प्रतिक्रिया सीधे कोशिकाओं फिक्सिंग और 610 एनएम पर absorbance को मापने के बजाय कोशिकाओं को इकट्ठा और ख-galactosidase गतिविधि के लिए 14 lysate का विश्लेषण करके मात्रा निर्धारित किया गया। एक अन्य संशोधन आरए प्रतिक्रिया की मात्रा का ठहराव के लिए पहले F9 दुर्लभ lacZ के साथ अलग नमूनों की प्रत्यक्ष सह संस्कृति है। पिछले विधियों अलग नमूने संवर्धन और F9 के लिए दुर्लभ-lacZ 16,18 इन संस्कृतियों से ही मीडिया को जोड़ने की सूचना दी।
अपने जा रहा है एक शक्तिशाली प्रणाली के बावजूद, F9 दुर्लभ lacZ संवाददाता परख कई सीमाएं हैं। इस संवाददाता सेल लाइन की एक सीमा है कि यह सब पार आरए की उपस्थिति के लिए दृढ़ता से प्रतिक्रिया करता है, हालांकि, यह भी 9-सीआईएस आरए और 13-सीआईएस आरए सहित अन्य retinoic एसिड isomers के लिए प्रतिक्रिया करता है; हालांकि, वे सब पार आरए कंपनियों को और अधिक संवेदनशील 100 गुना कर रहे हैंअन्य isomers 18 के लिए लाल। इस प्रणाली के लिए एक और सीमा रैखिक खुराक पर निर्भर प्रतिक्रिया केवल 10 -7 के लिए 10 -13 मीटर के बीच होती है एम-आरए 14,18; इस प्रकार, इन सीमाओं के बाहर आरए स्तर की तुलना करते हैं, तो यह जरूरी है कि जब तक माप रैखिक सीमा के भीतर गिर नमूने के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करने के लिए हो सकता है। अन्त में, क्योंकि यह मुख्य रूप से एक वर्णमिति परख है, रंग विकास के समापन बिंदु के नमूने और प्रयोगों के बीच अलग अलग होंगे। इस प्रकार, यह है कि एक मानक वक्र हमेशा क्रम में हर एक प्रयोग के लिए समानांतर में चढ़ाया जा संवाददाता सेल प्रतिक्रिया की मात्रा का ठहराव के लिए इसका इस्तेमाल करने के लिए महत्वपूर्ण है।
अंत में, हम F9 दुर्लभ lacZ आरए संवाददाता सेल लाइन के उपयोग को सूचित किया है E8.5 भ्रूण में मात्रात्मक आरए के स्तर को मापने के लिए और, पहले unreported, neurospheres में। इस संवाददाता प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा वास्तव में किसी भी कोशिका या ऊतक प्रकार में आरए स्तर की मात्रा का ठहराव अनुमति हो सकती है, और एमप्र भविष्य में विभिन्न अनुप्रयोगों के विकास में परिणाम।
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) for providing us with the F9 RARE-LacZ cells and technical support. This study is funded by the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (NJCSCR) (Grantnumber:10-3092-SCR-E-0) and the New Jersey Commission on Brain Injury Research (NJCBIR) (Grant number: CBIR13FEL006).
C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain | Jackson Laboratory | 000316 | |
F9 RARE-LacZ reporter cell line | from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) | ||
DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES) | ThermoFisher Scientific | 11330-057 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 C for media preparation |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive |
G418 | ThermoFisher Scientific | 10131-027 | Store at 4 °C; light-sensitive |
2% Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Store at 4 °C |
B-27 supplement (2 % stock solution) | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation |
Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 °C |
Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic | PeproTech | 450-33 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 °C |
50% glutaraldehyde | Amresco | M155 | Store at 4 C |
Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O) | Sigma Aldrich | D5670 | Store at room temperature |
potassium ferrocyanide (K₄[Fe(CN)₆] · 3H₂O) | Sigma Aldrich | P-9387 | Store at room temperature |
potassium ferricyanide (K₃[Fe(CN)₆]) | Sigma Aldrich | P-8131 | Store at room temperature |
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) | Promega | V3941 | Store stock at -20 °C |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 41639 | Store at room temperature |
all-trans Retinoic Acid (at-RA) | Sigma Aldrich | R-2625 | Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light |
TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12605-010 | Store at room temperature |
0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200-056 | alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 C |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | Store at 4 C |
10X phosphate buffered solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Store at 4 C |
Papain | Worthington | LK003176 | Store at 4 °C. |
Trypsin | Worthington | LS003703 | Store in 1 ml aliquots at -20 °C. |
Hyaluronic acid | Calbiochem | 385908 | Store 200 μl aliquots at -20 °C. |
DNaseI | Worthington | LS002139 | Store in 200 μl aliquots at -20 C |
Kynurenic acid | Sigma Aldrich | K3375 | Store in 200 μl aliquots at -20 C |
95% ethanol | |||
Mr. Frosty Freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
10 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
10 cm culture dish (cell culture treated) | |||
6 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
96-well cell culture plates | |||
1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
1.5 ml amber microcentrifuge tubes | |||
1.5 ml cryovials | |||
37 °C water bath | |||
surgical scissors | |||
fine surgical scissors | |||
no. 5 forceps | |||
blunt-ended forceps | |||
scalpel blade | |||
glass pasteur pipettes | |||
cotton | |||
alcohol lamp | |||
ELISA plate reader | |||
stereomicroscope |