माउस डिम्बग्रंथि वसा पैड में प्रत्यारोपण
Summary
हम एक डिम्बग्रंथि सनक पैड प्रत्यारोपण महिला प्रजनन पथ के सामान्य और तब्दील epithelia के अध्ययन के लिए उपयुक्त परख का वर्णन है। माउस वसा पैड बड़े ऊतक टुकड़े के प्रत्यारोपण की अनुमति देता है, सर्जरी और इमेजिंग के लिए आसानी से सुलभ है, और Müllerian मूल के ऊतकों के लिए सबसे अनुकूल देशी वातावरण प्रदान करता है।
Abstract
Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.
Introduction
प्रत्यारोपण assays है, जो चूहों में विशिष्ट शरीर साइटों में कोशिकाओं और ऊतकों की शुरूआत शामिल है, ऊतक उत्थान और carcinogenesis के अध्ययन के लिए एक आवश्यक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिकाओं के प्रत्यारोपण Orthotopic, वह है, एक देशी परिवेश में उनकी नियुक्ति, वयस्क स्टेम कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। स्तन स्टेम सेल का अस्तित्व पहले ग्रंथि से मुक्त चूहों 1 के स्तन वसा पैड में उपकला स्तन ग्रंथि के टुकड़े के प्रत्यारोपण द्वारा सुझाव दिया गया था। Humanized माउस वसा पैड 2 के लिए engraftment assays मानव प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं के पुनर्योजी क्षमता और सामान्य विकास पुनरावृत्ति करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इसके अलावा, मंजूरी दे दी स्तन वसा पैड में phenotypically अलग प्रकार की कोशिकाओं के धारावाहिक और सीमित कमजोर पड़ने प्रत्यारोपण स्तन स्टेम कोशिकाओं को 3-5 की आत्म नवीकरण क्षमता और multilineage भेदभाव का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण थे। combinat में प्रत्यारोपण assaysआनुवंशिक वंश के साथ आयन स्तन कैंसरजनन 5 में मूल के सेल के सबूत प्रदान की अनुरेखण। गुर्दा प्रत्यारोपण कैप्सूल आमतौर पर ख्यात प्रोस्टेट स्टेम कोशिकाओं 6 के गुणों के परीक्षण के लिए उपयोग किया जाता है। सामान्य और नवोत्पादित माउस और मानव अग्नाशय organoids की Orthotopic प्रत्यारोपण जीन और रास्ते कैंसर की प्रगति 7 में बदल पता चला। मूल पर्यावरण के महत्व को भी विविध उत्थान के प्रदर्शन के द्वारा समर्थित किया गया इस तरह के स्तन वसा पैड, कंधे वसा पैड, और वापस त्वचा 8 के रूप में अलग-अलग स्थानों में पसीने की ग्रंथियों के बाद engraftments गया है।
पेरिटोनियल गुहा और डिम्बग्रंथि बर्सा आमतौर पर महिला प्रजनन पथ 9-12 की उपकला कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए ओर्थोटोपिक स्थानों के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। इन तरीकों के दोनों सीमाओं की एक संख्या है। कोशिकाओं के इंजेक्शन इंट्रापेरिटोनियल पेरिटोनियल गुहा के विभिन्न क्षेत्रों में अपने implantations की ओर जाता है, जिससे कॉमसेलुलर विकास की निगरानी plicating। इसके अलावा, microenvironment में बदलाव, ऐसे vascularization, तंत्रिका वितरण और प्रतिरक्षा सेल प्रतिनिधित्व की हद तक के रूप में, पेरिटोनियल गुहा के विभिन्न क्षेत्रों में काफी महत्वपूर्ण हो सकता है। डिम्बग्रंथि बर्सा तरल के कोई 10 से अधिक μl के इंजेक्शन की अनुमति देता है, एक बहुत ही सीमित मात्रा है। यह काफी कोशिकाओं की राशि है कि दिलाई जा सकती है सीमा। इसके अलावा, डिम्बग्रंथि बर्सा में इंजेक्शन काफी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है और प्रक्रिया के समय का एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता है।
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम डिम्बग्रंथि वसा पैड गुणों का लाभ ले लिया है। माउस डिम्बग्रंथि वसा पैड के एक बड़े आकार की है, अंडाशय और गर्भाशय ट्यूब के निकट है, और सर्जरी के द्वारा आसानी से सुलभ है। यह बताया गया है कि घोड़े का trophoblast माउस डिम्बग्रंथि वसा पैड 13 में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। हालांकि इस पद्धति का ब्यौरा वर्णित नहीं कर रहे थे। यह भी अगर यह मुझे सूचना नहीं मिलीThod वयस्क कोशिकाओं और ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है। यहाँ, हम माउस और महिला प्रजनन पथ के मानव कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण का वर्णन है और पता चलता है कि इस पद्धति का भी लंबी अवधि के अंग प्रत्यारोपण के लिए लागू है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक डिम्बग्रंथि वसा पैड प्रत्यारोपण परख जो सही वितरण और उपकला कोशिकाओं और ऊतकों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है की स्थापना की है। डिम्बग्रंथि वसा पैड परख प्रत्यारोपण प्रक्रिया कम तकनीकी intrabursal इंजेक्शन 10-12 से चुनौती दे रहा है और अधिक समान और के रूप में intraperitoneal इंजेक्शन 9 की तुलना में प्रतिरोपित कोशिकाओं के सटीक स्थान के लिए अनुमति देता है। यह भी अच्छी तरह से इस तरह के गर्भाशय ट्यूब के रूप में एक पूरे अंग है, की लंबी अवधि के प्रत्यारोपण के लिए अनुकूल है।
महत्वपूर्ण बात है, डिम्बग्रंथि वसा पैड महिला प्रजनन प्रणाली के epithelia के लिए एक परिचित microenvironment प्रदान करता है। यह उत्थान और घातक परिवर्तन के दौरान मानव और माउस डिम्बग्रंथि और ट्यूबल उपकला कोशिकाओं की आणविक और सेलुलर गुणों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त होना चाहिए। अन्य अंगों के विपरीत, कुछ अध्ययनों महिला आर के epithelia में पहचान और स्टेम कोशिकाओं के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया हैeproductive पथ 18,19। इस तरह के अध्ययन क्योंकि कई तरह के कैंसर वयस्क स्टेम सेल 20 से उत्पन्न माना जाता है विशेष महत्व के हैं। उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर का अभी तक सेलुलर मूल अत्यधिक बहस का मुद्दा 18 में रहते हैं। उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर डिम्बग्रंथि के कैंसर के बहुमत के लिए खाते और अमेरिका के 21 में महिलाओं की सभी कैंसर से संबंधित मौतों के बीच में 5 वें स्थान पर है। मौजूदा प्रत्यारोपण तकनीक 9-12 पर कई फायदे के साथ एक orthotopic परख के इस प्रकार के विकास बहुत इस क्षेत्र में अध्ययन की सुविधा चाहिए।
डिम्बग्रंथि वसा पैड के सतही स्थान को देखते हुए, छोटे पशु इमेजिंग सिस्टम पर मजबूत फ्लोरोसेंट या bioluminescent संवाददाताओं के साथ लेबल engraftments पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह भी इस तरह के गैर रेखीय माइक्रोस्कोपी 22 के रूप में न्यूनतम इनवेसिव उच्च संकल्प रहते इमेजिंग assays, स्थापित करने के लिए संभव होना चाहिए। डिम्बग्रंथि वसा पैड भी अंग संस्कृतियों में रखा जा सकता है, जिससे की अनुमति देते हैंबारीकी से कोशिकाओं के संगठन और बाह्य मैट्रिक्स recapitulating की शर्तों के तहत सामान्य और नवोत्पादित epithelia के तीन आयामी संस्कृति हैैं। भविष्य के अध्ययन के इन होनहार संभावनाओं का पता होना चाहिए।
कई महत्वपूर्ण कदम माना जा है। एक हीटिंग पैड उपलब्ध कराना और सर्जरी के दौरान मूषक गर्म रखने के काफी सुधार जीवित रहने की दर। वसा पैड से निपटने के साधन के बाँझपन सुनिश्चित करता है कि engrafted सिस्टम बाँझ रखा जाता है। हमारे अनुभव, प्रत्यारोपण के विकास मंदता में महत्वपूर्ण खून बह रहा है परिणामों में। महत्वपूर्ण बात है, वसा पैड चीरा ठीक बनाया जाना चाहिए क्योंकि वसा पैड फाड़ या खून बह रहा कारणों के माध्यम से यह puncturing। Coagulants खून बह रहा है के रूप में आवश्यक को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। अगर engraftments विकसित नहीं है, इंजेक्शन कोशिकाओं के एक उच्च एकाग्रता से विचार किया जाना चाहिए। पहली सफल outgrowths प्रत्यारोपण के बाद एक सप्ताह के रूप में जल्दी के रूप में देखा जा सकता है और सबसे engraftments दिखाई एक होना चाहिएप्रक्रिया के बाद महीने। प्रत्यारोपण के लिए, बड़ा व्यास (23-25 जी) के साथ सुई (व्यास में 10 माइक्रोन से अधिक) बड़े कोशिकाओं के बाल काटना को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह सुइयों वसा पैड के लिए और अधिक दर्दनाक हो सकता है और उनके उपयोग के लिए अग्रिम में परीक्षण किया जाना चाहिए। हमारे प्रयोगों के लिए हम 6 से 8 सप्ताह पुरानी दाता और प्राप्तकर्ता चूहों का इस्तेमाल किया है। दोनों उद्देश्यों के लिए छोटे या बड़े चूहों का इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। छोटे दानदाताओं में डिम्बग्रंथि वसा पैड के छोटे आकार पर भी विचार करने की आवश्यकता होगी।
किसी भी तरीके के साथ के रूप में, वहाँ माउस डिम्बग्रंथि वसा पैड प्रत्यारोपण परख की कुछ सीमाएं हैं। syngeneic इम्युनो-सक्षम चूहों murine प्राथमिक कोशिकाओं / ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हमारी तकनीक एनएसजी या मानव सामग्री के प्रत्यारोपण के लिए SCID चूहों की आवश्यकता है। यह मानव उपकला कोशिकाओं के विकास का समर्थन करने के लिए वसा पैड मानवीयकरण की संभावना संभव है। हालांकि, हम अभी तक इस दृष्टिकोण परीक्षण नहीं किया है। युवा फे का उपयोगपुरुषों में कम प्रजनन लागत के लिए नेतृत्व करने के लिए कर सकते हैं; हालांकि, परिपक्व वर्जिन मादा चूहों (उम्र 8 से 10 सप्ताह) जिससे बड़ा नमूनों के प्रत्यारोपण की अनुमति के एक बड़े वसा पैड है। अंत में, प्रयोगशाला कर्मियों पशु शल्य चिकित्सा में प्रशिक्षित किया जाना चाहिए प्रक्रिया का समय पर और सफल क्रियान्वयन सुनिश्चित करने के लिए।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम, डॉ एंड्रयू लालकृष्ण गॉडविन, केन्सास विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर का शुक्रिया अदा करने के लिए मानव कोशिकाओं HIO118 प्रदान करने के लिए करना चाहते हैं। (; T028095 NYSTEM) और बाल स्वास्थ्य और AFN करने के लिए मानव विकास (P50HD076210) के स्वास्थ्य / राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थानों, और NYSTEM (C028125, C024174 और से अनुदान द्वारा इन अध्ययनों से न्यू यॉर्क में स्टेम सेल कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित थे T028095), स्वास्थ्य / राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (CA182413) और Ayn करने के लिए डिम्बग्रंथि के कैंसर रिसर्च फंड (327516) के राष्ट्रीय संस्थानों।
Materials
| 25 gauge needle | BD Becton Dickinson | 305122 | |
| 28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle) | Kendall | 30339 | Part Number: 8881500014 |
| basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
| basement membrane matrix (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
| β-actin-DsRed mice | The Jackson Laboratory | 6051 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
| β-actin-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| bovine albumin | Sigma-Aldrich | A3311 | |
| chloroform | VWR | EM-CX1058-1 | |
| collagenase/hyaluronidase | Stem Cell Technologies | 7912 | |
| cryogenic vials | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
| dispase II | Worthington | NPRO2 | |
| DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
| DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
| embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| ethanol 200 proof | Koptec | V1001 | to prepare 70% |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| filter tip 0.1-10/20µlXL | USA Scientific | 1120-3810 | |
| FOXJ1 antibody | eBioscience | E10109-1632 | used at concentration 1:1000 (no unmasking) |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| laboratory film (Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
| L-Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| insulin-transferin-sodium selenite | Sigma-Aldrich | I884 | |
| isoflurane, 250 ml | Santa Cruz Animal Health | sc-363629Rx | |
| low attachment plate 24-well | Costar | 3473 | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| metal histology molds | Electron Microscopy Sciences | 62527-22 | |
| microscope, inverted | Nikon | Eclipse TS 100 | |
| microscope, stereo | Nikon | SMZ800 | |
| Nod/SCID/gamma (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
| paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| paraffin (Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
| PAX8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | used at concentration 1:1000 (no unmasking) |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-030-CV | |
| penicillin streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
| sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| specimen processing gel (HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Trypsin-EDTA, 25% | Corning | 25-053-Cl |
References
- Deome, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Reconstruction of human mammary tissues in a mouse model. Nature protocols. 1, 206-214 (2006).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Caldas, C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer. 7, 791-799 (2007).
- Koren, S., et al. PIK3CA(H1047R) induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525, 114-118 (2015).
- Nikitin, A. Y., Nafus, M. G., Zhou, Z., Liao, C. -. P., Roy-Burman, P., Bagley, R. G., Teicher, B. A. Prostate stem cells and cancer in animals. Stem Cells and Cancer. , 199-216 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, 324-338 (2015).
- Lu, C. P., et al. Identification of stem cell populations in sweat glands and ducts reveals roles in homeostasis and wound repair. Cell. 150, 136-150 (2012).
- Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
- Orsulic, S., et al. Induction of ovarian cancer by defined multiple genetic changes in a mouse model system. Cancer Cell. 1, 53-62 (2002).
- Dawes, J., Liu, B., Mars, W., Michalopoulos, G., Khillan, J. S. Multiple ovarian transplants to rescue a transgenic line of mice. Lab Anim (NY). 39, 191-193 (2010).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Albihn, A., et al. Production of capsular material by equine trophoblast transplanted into immunodeficient mice. Reproduction. 125, 855-863 (2003).
- Muthusamy, N., Vijayakumar, A., Cheng, G., Ghashghaei, H. T. A knock-in Foxj1(CreERT2::GFP) mouse for recombination in epithelial cells with motile cilia. Genesis. 52, 350-358 (2014).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24, 751-765 (2013).
- Capo-Chichi, C. D., et al. Dynamic alterations of the extracellular environment of ovarian surface epithelial cells in premalignant transformation, tumorigenicity, and metastasis. Cancer. 95, 1802-1815 (2002).
- Roland, I. H., et al. Loss of surface and cyst epithelial basement membranes and preneoplastic morphologic changes in prophylactic oophorectomies. Cancer. 98, 2607-2623 (2003).
- Flesken-Nikitin, A., Odai-Afotey, A. A., Nikitin, A. Y. Role of the stem cell niche in the pathogenesis of epithelial ovarian cancers. Mol Cell Oncol. 1, 963435 (2014).
- Ng, A., Barker, N. Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).
- Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469, 314-322 (2011).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
- Williams, R. M., et al. Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy. Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).
