Vi beskriver en eggstokkkjepphest pad transplantasjon analysen egnet for studier av normale og forvandlet epitel av den kvinnelige skjede. Musen fettpute gjør transplantasjon av store vev fragmenter, er lett tilgjengelig for kirurgi og bildebehandling, og gir den mest gunstige opprinnelige miljø for vev av Mullerian opprinnelse.
Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.
Transplantasjons analyser, som innebærer innføring av celler og vev i spesifikke kroppssteder i mus, representere et viktig metode for studier av vev regenerering og karsinogenese. Ortotopiske transplantasjoner av celler, det vil si, deres plassering i en innfødt miljø, er spesielt viktig for karakterisering av voksne stamceller. Eksistensen av melke stamceller ble først foreslått av transplantasjon av epitelceller brystkjerteltumorer fragmenter inn kjertel frie melkefettputer av mus 1. Engraftment analyser til humanisert musefettpute 2 ble brukt til å rekapitulere den regenerative potensial og normal utvikling av menneskelige primære bryst epitelceller. Videre serie og begrensende fortynning transplantasjoner av fenotypisk forskjellige celletyper i det ryddet melkefettpute var avgjørende for å teste selvfornyelse kapasitet og multilineage differensiering av melke stamceller 3-5. Transplantasjonsforsøk i combination med genetisk avstamning tracing gitt bevis av cellen opprinnelses i brystkreft 5. Nyre kapsel transplantasjoner blir ofte brukt for å teste egenskapene til antatt prostata stamceller 6. Orthotopic transplantasjon av normal og neoplastiske mus og menneskelige bukspyttkjertelen organoids avslørt gener og stier endret i kreft progresjon 7. Betydningen av de innfødte miljøet har også vært støttet av demonstrasjon av diverse regenerering etter engraftments av svettekjertler i ulike steder, for eksempel melkefettputer, skulder fett pads, og tilbake hud åtte.
Bukhulen og eggstokkreft bursa er vanligvis brukt som steder for orthotopic transplantasjon av epitelceller kvinnelige skjede 9-12. Begge disse metoder har en rekke begrensninger. Intraperitoneal injeksjon av celler som fører til deres implantasjoner i ulike områder av bukhulen, hvorved complicating overvåking cellevekst. Videre variasjoner i mikromiljøet, for eksempel graden av vaskularisering, innervasjon og immuncelle representasjon, kan være ganske betydelig i forskjellige områder av bukhulen. Ovarial bursa har et svært begrenset volum, slik at injeksjon av ikke mer enn 10 ul væske. Dette begrenser mengden av celler som kan administreres i betydelig grad. Videre kan injeksjoner i eggstokk bursa være ganske teknisk utfordrende og framgangsmåten krever en betydelig mengde av tid.
For å møte disse begrensningene, har vi tatt nytte av eggstokkene fett puten egenskaper. Musen eggstokkreft fett puten har en stor størrelse, ligger ved siden av eggstokk og livmor rør, og er lett tilgjengelig med kirurgi. Det har blitt rapportert at equine trophoblast kan transplanteres inn i museeggstokkfettputen 13. Men detaljene i denne metoden ble beskrevet. Det ble heller ikke rapportert om dette er megthod kan brukes på voksne celler og vev. Her beskriver vi en pålitelig metode for transplantering av mus og humane celler i det kvinnelige reproduksjonssystemet og viser at denne fremgangsmåte er også anvendelig for langsiktig organtransplantasjon.
Vi har etablert en ovarian fettpute transplantasjon analysen som gir mulighet for presis levering og påvisning av epitelceller og vev. Ovarial fettpute analyse transplantasjon prosedyre er mindre teknisk krevende enn intrabursal injeksjon 10-12 og gir mulighet for mer ensartet og nøyaktig plassering av transplanterte celler sammenlignet med intraperitoneal injeksjon ni. Det er også godt egnet for langtids transplantasjon av en hel organ, slik som livmor røret.
Viktigere, gir eggstokk fett puten en kjent mikromiljøet for epithelia av den kvinnelige reproduktive system. Det skulle være spesielt egnet for studier av de molekylære og cellulære egenskapene for humant og mus ovarie og tubene epitel celler under regenerering og ondartet transformasjon. I motsetning til andre organer, er det få studier fokusert på identifisering og karakterisering av stamceller i epitel av hunn reproductive kanalen 18,19. Slike studier er av særlig betydning fordi mange kreftformer antas å stamme fra voksne stamceller 20. Likevel cellulære opprinnelse epiteliale eggstokkreft er fortsatt svært diskutabelt 18. Epitelial eggstokkreft står for størsteparten av eggstokkreft og er på 5. plass blant alle kreftrelaterte dødsfall av kvinner i USA 21. Dermed utviklingen av en orthotopic analysen med flere fordeler fremfor eksisterende transplantasjonsteknikker 9-12 skal i stor grad forenkle studier på dette området.
Gitt den overfladiske plasseringen av eggstokkreft fett puten, kan små dyr imaging-systemer brukes til å følge opp engraftments merket med sterk fluoriserende eller bioluminescent reportere. Det bør også være mulig å etablere minimalt invasive høyoppløselige levende bildeanalyser, slik som ikke-lineær mikroskopi 22. Den ovarian fett puten kan også holdes i organkulturer, for derved å tillateing tredimensjonal kultur av normale og neoplastiske epitel under betingelser tett rekapitulere organisering av celler og den ekstracellulære matriks. Fremtidige studier bør løse disse lovende muligheter.
Flere viktige skritt må tas i betraktning. Gir en varmepute og holde gnagere varm under operasjonen forbedrer overlevelsesraten. Sterilitet av instrumenter håndtering av fett puten sørger for at innpodet systemene holdes sterile. Vår erfaring er betydelige blødninger fører til veksthemming av transplantasjoner. Viktigere, bør fettpute innsnitt gjøres nettopp fordi rive fett puten eller punktering det gjennom forårsaker blødninger. Koagulanter skal brukes for å stoppe blødninger etter behov. Hvis engraftments utvikler ikke, bør en høyere konsentrasjon av injiserte celler vurderes. De første vellykkede utvekster kan observeres så tidlig som en uke etter transplantasjon og mest engraftments skal være synlig enmåned etter inngrepet. For transplantasjon, kan nåler med større diameter (23-25 g) anvendes for å forhindre skjæring av store celler (over 10 mikrometer i diameter). Imidlertid kan slike nåler er mer traumatisk for det fett puten og bruken av disse bør testes på forhånd. For våre forsøk har vi brukt 6-8 uker gamle giver- og mottaker mus. For begge formål yngre og eldre mus kan anvendes. Imidlertid kan trenge antall injiserte celler som skal justeres. Den mindre størrelsen på eggstokkene fettputer i yngre givere må også vurderes.
Som med alle metoder, er det noen begrensninger av muse ovarial fettputen transplantasjon assay. Selv om syngeniske immuno-kompetente mus kan brukes til murine primære celler / vev, krever vår teknikk NSG eller SCID-mus for transplantasjon av humant materiale. Det er sannsynlig mulig å humanfettpute for å understøtte veksten av humane epitelceller. Vi har imidlertid ikke testet denne tilnærmingen enda. Bruk av yngre femenn kan føre til lavere avl kostnader; Men modne jomfrue hunnmus (alder 8 til 10 uker) har en større fettpute, og dermed lar transplantasjon av større prøver. Til slutt bør laboratoriepersonell være opplært i dyr operasjon for å sikre tidsriktig og vellykket gjennomføring av prosedyren.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Dr. Andrew K. Godwin, University of Kansas Medical Center, for å gi de menneskelige celler HIO118. Disse studiene ble støttet av tilskudd fra New York Stem Cell Program (NYSTEM, T028095) og National Institutes of Health / National Institute of Child Health and Human Development (P50HD076210) til AFN, og ved tilskudd fra NYSTEM (C028125, C024174 og T028095), National Institutes of Health / National Cancer Institute (CA182413) og Ovarian Cancer Research Fund (327516) til Ayn.
25 gauge needle | BD Becton Dickinson | 305122 | |
28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle) | Kendall | 30339 | Part Number: 8881500014 |
basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
basement membrane matrix (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
β-actin-DsRed mice | The Jackson Laboratory | 6051 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
β-actin-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
bovine albumin | Sigma-Aldrich | A3311 | |
chloroform | VWR | EM-CX1058-1 | |
collagenase/hyaluronidase | Stem Cell Technologies | 7912 | |
cryogenic vials | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
dispase II | Worthington | NPRO2 | |
DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
ethanol 200 proof | Koptec | V1001 | to prepare 70% |
fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
filter tip 0.1-10/20µlXL | USA Scientific | 1120-3810 | |
FOXJ1 antibody | eBioscience | E10109-1632 | used at concentration 1:1000 (no unmasking) |
hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
laboratory film (Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
L-Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
insulin-transferin-sodium selenite | Sigma-Aldrich | I884 | |
isoflurane, 250 ml | Santa Cruz Animal Health | sc-363629Rx | |
low attachment plate 24-well | Costar | 3473 | |
MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
metal histology molds | Electron Microscopy Sciences | 62527-22 | |
microscope, inverted | Nikon | Eclipse TS 100 | |
microscope, stereo | Nikon | SMZ800 | |
Nod/SCID/gamma (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
paraffin (Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
PAX8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | used at concentration 1:1000 (no unmasking) |
PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-030-CV | |
penicillin streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
specimen processing gel (HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Trypsin-EDTA, 25% | Corning | 25-053-Cl |