Vi beskriver en äggstocksmodefluga pad transplantation analys lämplig för studier av normala och transformerade epitel i de kvinnliga reproduktionsorganen. Musen fett pad tillåter transplantation av stora vävnadsfragment, är lättillgängligt för kirurgi och bildbehandling, och ger den mest gynnsamma naturliga miljö för vävnader Müllerian ursprung.
Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.
Transplantations analyser, som involverar införandet av celler och vävnader till specifika kroppsställen i möss, utgör en viktig strategi för studier av vävnadsregenerering och cancer. Orthotopic transplantationer av celler, det vill säga deras placering i en infödd miljö, är särskilt viktiga för karakterisering av vuxna stamceller. Förekomsten av bröst stamceller föreslogs först av transplantation av epiteliala bröstkörtel fragment i körtelfria bröstfettkuddarna hos möss 1. Engraftment analyser till humaniserad mus fettkudden 2 användes för att rekapitulera den regenerativa potential och normal utveckling av humana primära bröstepitelceller. Dessutom seriella och begränsande utspädningstransplantationer av fenotypiskt distinkta celltyper i den rensas bröstfettkudden var avgörande för att testa självförnyelse kapacitet och multilineage differentiering av bröst stamceller 3-5. Transplantations analyser i combinatjon med genetisk härstamning spårning bevisat att cellen ursprungs bröst cancer 5. Njurkapseln transplantationer används vanligen för att testa egenskaperna hos förmodade prostatastamceller 6. Orthotopic transplantation av normal och neoplastisk mus och mänskliga pankreas organoids avslöjade gener och vägar förändras i cancerutveckling 7. Betydelsen av naturliga miljö har också fått stöd av demonstrationen av olika regeneration efter engraftments av svettkörtlar i olika platser, såsom bröstfettkuddar, axelfettkuddar och tillbaka hud 8.
Bukhålan och äggstocks bursa används vanligen som platser för orthotopic transplantation av epitelceller i det kvinnliga reproduktionsorganen 9-12. Båda dessa metoder har ett antal begränsningar. Intraperitoneal injektion av celler leder till deras implantationer inom olika områden av peritonealhålan, vari complicating övervaka cellulär tillväxt. Vidare variationer i mikromiljön, såsom omfattningen av vaskularisering, innervation och immuncellrepresentation, kan vara ganska betydande i olika områden i bukhålan. Äggstocks bursa har en mycket begränsad volym, vilket möjliggör injektion av högst 10 l vätska. Detta begränsar avsevärt den mängd celler som kan administreras. Dessutom kan injektioner i äggstocks bursa vara ganska tekniskt utmanande och förfarandet kräver en avsevärd tid.
Ta itu med dessa begränsningar, har vi dragit fördel av de ovariala fettkudden egenskaper. Musen äggstocksfettkudden har en stor storlek, ligger i anslutning till äggstocken och livmoderröret, och är lätt att nå med kirurgi. Det har rapporterats att equine trofoblast kan transplanteras i musen äggstocksfettkudden 13. Dock till detaljer om denna metod inte har beskrivits. Det var också inte rapporterats om detta migThOD kan appliceras på vuxna celler och vävnader. Här beskriver vi en tillförlitlig metod för transplantation av mus och humana celler av de kvinnliga reproduktionsorganen och visar att denna metod också kan tillämpas på långtidsorgantransplantation.
Vi har etablerat en äggstocksfettkudden transplantation analys som gör det möjligt att korrekt leverans och detektion av epitelceller och vävnader. Äggstocksfettkudden analys transplantation förfarande är mindre tekniskt utmanande än intrabursal injektion 10-12 och möjliggör en mer enhetlig och exakt lokalisering av transplanterade celler jämfört med intraperitoneal injektion 9. Det är också väl lämpad för långtids transplantation av ett helt organ, såsom livmoderröret.
Viktigt ger äggstocksfettkudden en bekant mikro för epitel av den kvinnliga reproduktiva systemet. Det bör vara särskilt lämpliga för studier av de molekylära och cellulära egenskaper hos människa och mus äggstocks- och äggledarna epitelceller under förnyelse och malign transformation. I motsats till andra organ, har få studier med inriktning på identifiering och karakterisering av stamceller i epitel av den kvinnliga reproductive kanalen 18,19. Sådana studier är av särskild betydelse eftersom många cancerformer tros härröra från vuxna stamceller 20. Ändå cellulära ursprung äggstockscancer fortsatt mycket diskutabel 18. Äggstockscancer står för merparten av äggstockscancer och är i 5: e plats bland alla cancerrelaterade dödsfall bland kvinnor i USA 21. Således utveckling av en orthotopic analys med flera fördelar jämfört med befintliga transplantationsteknik 9-12 i hög grad bör underlätta studier inom detta område.
Med tanke på den ytliga platsen för äggstocks fett pad, kan små djur bildsystem användas för att följa upp engraftments märkt med stark fluorescerande eller självlysande reportrar. Det bör också vara möjligt att fastställa minimalt invasiva högupplösta levande imaging analyser, såsom icke-linjär mikroskopi 22. Äggstocks fett pad kan också hållas i organkulturer och därmed tillåtaing tredimensionella kultur av normal och neoplastisk epitel under förhållanden nära rekapitulera organisation av celler och den extracellulära matrisen. Framtida studier bör ta itu med dessa lovande möjligheter.
Flera viktiga steg måste beaktas. Tillhandahålla en värmedyna och hålla gnagare varm under operation förbättrar avsevärt överlevnaden. Sterilitet av instrument som hanterar fettkudden säkerställer att engrafted systemen hålls sterila. I vår erfarenhet, signifikant blödning resulterar i tillväxthämning av transplantationer. Viktigt bör fettkudden snitt göras just därför att riva fettkudden eller punktering det genom orsaker blödning. Koaguleringsmedel bör användas för att stoppa blödning vid behov. Om engraftments inte utvecklas, bör betraktas som en högre koncentration av injicerade celler. De första lyckade utväxter kan observeras så tidigt som en vecka efter transplantationen och mest engraftments bör vara synlig enmånad efter ingreppet. För transplantation, kan nålar med större diameter (23-25 G) användas för att förhindra skjuvning av stora celler (över 10 ^ m i diameter). Emellertid kan sådana nålar vara mer traumatisk för fettkudden och deras användning bör testas i förväg. För våra experiment har vi använt 6 till 8 veckor gamla donator- och mottagarmöss. För båda ändamål kan användas yngre eller äldre möss. Emellertid kan antalet injicerade celler behöva justeras. Den mindre storleken av äggstocksfettkuddar i yngre givare kommer också att behöva övervägas.
Som med alla metoder, finns det vissa begränsningar på musen äggstocksfettkudden transplantationsanalys. Även syngena immunkompetenta möss kan användas för murina primära celler / vävnader, kräver vår teknik NSG eller SCID-möss för transplantation av mänskligt material. Det är sannolikt möjligt att humanisera fettkudden för att stödja tillväxten av humana epitelceller. Men vi har inte testat detta tillvägagångssätt ännu. Användning av yngre femän kan leda till lägre avels kostnader; emellertid mogna jungfru honmöss (ålder 8 till 10 veckor) har en större fettkudden, varigenom transplantation av större prover. Slutligen bör laboratoriepersonal utbildas i djur kirurgi för att säkerställa ett snabbt och framgångsrikt genomförande av förfarandet.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr Andrew K. Godwin, University of Kansas Medical Center, för att ge de mänskliga celler HIO118. Dessa studier stöddes av bidrag från New York Stem Cell Program (NYSTEM, T028095) och National Institutes of Health / National Institute of Child Health and Human Development (P50HD076210) till AFN, och av bidrag från NYSTEM (C028125, C024174 och T028095), National Institutes of Health / National Cancer Institute (CA182413) och äggstocks Cancer Research Fund (327.516) till AYN.
25 gauge needle | BD Becton Dickinson | 305122 | |
28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle) | Kendall | 30339 | Part Number: 8881500014 |
basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
basement membrane matrix (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
β-actin-DsRed mice | The Jackson Laboratory | 6051 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
β-actin-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
bovine albumin | Sigma-Aldrich | A3311 | |
chloroform | VWR | EM-CX1058-1 | |
collagenase/hyaluronidase | Stem Cell Technologies | 7912 | |
cryogenic vials | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
dispase II | Worthington | NPRO2 | |
DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
ethanol 200 proof | Koptec | V1001 | to prepare 70% |
fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
filter tip 0.1-10/20µlXL | USA Scientific | 1120-3810 | |
FOXJ1 antibody | eBioscience | E10109-1632 | used at concentration 1:1000 (no unmasking) |
hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
laboratory film (Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
L-Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
insulin-transferin-sodium selenite | Sigma-Aldrich | I884 | |
isoflurane, 250 ml | Santa Cruz Animal Health | sc-363629Rx | |
low attachment plate 24-well | Costar | 3473 | |
MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
metal histology molds | Electron Microscopy Sciences | 62527-22 | |
microscope, inverted | Nikon | Eclipse TS 100 | |
microscope, stereo | Nikon | SMZ800 | |
Nod/SCID/gamma (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
paraffin (Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
PAX8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | used at concentration 1:1000 (no unmasking) |
PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-030-CV | |
penicillin streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
specimen processing gel (HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Trypsin-EDTA, 25% | Corning | 25-053-Cl |