Procedure for Adaptive Laboratory Evolution af mikroorganismer Ved hjælp af en kemostat
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at opnå adaptiv laboratorium udvikling af mikroorganismer under forhold ved hjælp kemostatkultur. Desuden er genomisk analyse af den udviklede stamme diskuteret.
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
Mikroorganismer kan overleve og tilpasse sig forskellige miljøer. Under alvorlig stress, kan tilpasningen ske via opkøb af gavnlige fænotyper ved tilfældige genomiske mutationer og efterfølgende positiv selektion 1-3. Derfor kan mikrobielle celler tilpasse ved at ændre metaboliske eller regulerende net for optimal vækst, som kaldes "adaptiv evolution". Nylige vigtige mikrobielle tendenser, såsom udbrud af superbugs og forekomsten af robuste mikrobielle stammer, er meget nært beslægtet med adaptive evolution under stressende forhold. Under definerede laboratorieforhold, er vi i stand til at studere mekanismerne i molekylær evolution og endda styre retningen af mikrobiel evolution til forskellige applikationer. I modsætning til flercellede organismer, encellede organismer er velegnede til adaptiv laboratorium evolution (ALE) af følgende grunde: De regenerere hurtigt, de opretholder store befolkningsgrupper, og det er let at oprette og vedligeholde homogeneous miljøer. Kombineret med de seneste fremskridt inden for DNA-sekventering teknikker og avanceret teknologi, ALE giver mulighed for direkte observation af genomiske ændringer, der fører til systemiske lovgivningsmæssige ændringer. Mutations dynamik og en mangfoldighed af befolkningen er også observeres. Genetisk engineering strategier kan bestemmes ud fra en analyse af ALE stammer 4,5.
Kemostatkultur er en metode, der anvendes til at opnå steady-state-celler og øge produktiviteten i fermenteringsprocesser 6. Frisk medium tilsættes, og dyrkningsbouillonen høstes under processen (sidstnævnte omfatter medium og biomasse). Langsigtet kemostatkultur imidlertid ændrer steady-state produktivitet af kulturen og bevirker en akkumulering af spontane mutationer og selektion under dyrkning (figur 1a). Under forskellige udvalg tryk (stressfaktorer), er ophobning af mutationer forbedret. En gradvis forøgelse af stress i en langsigtet kemostat giver en kontinuerlig udvalg af mutationer, der arbejder imod de givne stressfaktorer, såsom temperatur, pH, osmotisk tryk, næringsstof sult, oxidation, giftige slutprodukter, osv Colony overførsel fra et fast medium og seriel overførsel fra et flydende medium (gentaget batch-kultur) tillader også forskere at opnå udviklet mikroorganismer (figur 1b og 1c). Selvom kemostatkultur kræver komplicerede metoder, puljen af mangfoldighed (antal gentagelser og befolkningens størrelse) er højere end den, der opnås ved hjælp af koloni overførsel og serielle forflytningsteknikker. Den stabile stress udsættelse for individuelle celler og formindsket variation i den cellulære tilstand under kemostatkultur (steady state) er andre fordele ved ALE sammenlignet med batch kultur-baserede teknikker. Stress-induceret ALE af Escherichia coli udsat for høje succinat- betingelser er indført i denne artikel.
Iles / ftp_upload / 54.446 / 54446fig1.jpg "/>
Figur 1: Metoder til adaptiv laboratorium evolution (A) kemostat;. (B) seriel overførsel (C) koloni overførsel. De øverste figurer illustrerer begrebet metoderne til ALE, og de nederste figurer illustrerer antallet af celler, der voksede i løbet ALE. Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroorganismer er i stand til at tilpasse sig næsten alle miljøer på grund af deres hurtige vækst og genetisk diversitet. Adaptive laboratorium evolution giver mikroorganismer til at udvikle sig under designede betingelser, som giver en måde at vælge individuelle organismer huser spontane mutationer, der er gavnlige under de givne betingelser.
Chemostaten teknik er mere robust for at opnå kunstigt drevet evolution end overførselsteknikken af følgende grunde: (a) en stabil mil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
