We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.
Membran proteiner (MPS) er viktige komponenter i cellemembraner og primær narkotika mål. Rasjonell drug design er avhengig av nøyaktig strukturell informasjon, vanligvis oppnås ved krystallografi; imidlertid MP'er er vanskelig å krystallisere. Framskritt i MP strukturbestemmelse har hatt stor nytte av utviklingen av lipidic kubikk fase (LCP) krystallisering metoder, som gir vanligvis godt diffraksjon, men ofte små krystaller som lider av stråleskader i løpet av tradisjonell krystallografiske datainnsamling på synkrotron kilder. Utvikling av ny generasjon X-ray fritt elektron laser (XFEL) kilder som produserer ekstremt lyse femtosecond pulser har aktivert romtemperatur datainnsamling fra mikrokrystaller med ingen eller ubetydelig stråleskader. Våre siste innsats i å kombinere LCP teknologi med serie femtosecond krystallografi (LCP-SFX) har resultert i høy oppløsning strukturer av flere menneskerettighets G protein-koblede reseptorer, wjør representerer en notorisk vanskelig mål for strukturbestemmelse. I LCP-SFX teknikk blir LCP rekruttert som en matriks for både vekst og levering av MP mikrokrystaller til krysset av injeksjonsstrømmen med en XFEL stråle for krystallografiske datainnsamling. Det har blitt demonstrert at LCP-SFX kan vesentlig forbedre diffraksjon oppløsning når bare under 10 um krystaller er tilgjengelige, eller når bruk av mindre krystaller ved værelsestemperatur kan overvinne forskjellige problemer i forbindelse med større cryocooled krystaller, som opphopning av defekter høy mosaicity og cryocooling gjenstander. Fremtidige fremskritt i røntgenkilder og detektorteknologi bør gjøre serie krystallografi svært attraktivt og praktisk for gjennomføring, ikke bare på XFELs, men også på mer tilgjengelige synkrotron beamlines. Her presenterer vi detaljerte visuelle protokoller for utarbeidelse, karakterisering og levering av mikrokrystaller i LCP for serie krystallografi-eksperimenter.Disse protokollene omfatter metoder for å gjennomføre krystallisering eksperimenter i sprøyter, oppdage og karakterisere det krystall prøvene, optimalisere krystalltettheten, lasting micro laden LCP inn i injeksjonsutstyr og levere prøven til bjelken for datainnsamling.
Røntgenkrystallografi er den mest vellykkede teknikken til dags dato for å løse atom oppløsning strukturer av membranproteiner (MPS). Krystallisering fra lipidic mesofaser, også kjent som lipidic kubikk fase (LCP), eller i meso krystallisering, representerer en av de store utbygginger i MP krystallografi som har aktivert den høyoppløselige strukturbestemmelse av utfordrende mål som G protein-koblede reseptorer (GPCR ) 1. Nye fremskritt i LCP verktøy og teknologier har gjort denne teknikken tilgjengelig for et stort fellesskap av strukturelle biologer verden rundt to. Men i mange tilfeller MP-krystallene som dannes i LCP er for små til å bli brukt selv ved de fleste avanserte mikrofokus synkrotron beamlines, hvor prøvene lider av den alvorlige stråleskader og forringelse før tilstrekkelig signal med høy oppløsning som kan oppnås tre.
En ny tilnærming til krystallografiske datainnsamlingble aktivert med igangkjøring av den første X-ray fritt elektron laser (XFEL). Metoden er basert på prinsippet om "diffraksjon før ødeleggelse", først introdusert teoretisk 4 og deretter bekreftet eksperimentelt på biologiske prøver ved Linac Coherent Light Source (LCLer) 3, verdens pioner i harde XFELs. En XFEL genererer høy lysstyrke røntgen pulser i løpet av få titalls femtosekundområdet varighet som diffract fra et perfekt krystall før proteinatomene kan bevege seg som reaksjon på stråleskader. I de innledende eksperimenter ble mikrokrystaller kontinuerlig tilført til skjæringspunktet med den XFEL bjelke i en vandig strøm som produseres av en væske injektor 5. Dette eksperimentelle oppsettet er kjent som serie femtosecond krystallografi (SFX). Den største ulempen med å bruke flytende injektorer for SFX er deres høye strømningshastighet, som dermed krever flere titalls til hundrevis av milligram renset protein for samling av en komplett datasett. ved employing en spesiell injektor som kan håndtere de gel-lignende LCP prøver (LCP microextrusion injektor) 6, vi levert microcrystals av flere forskjellige menneskelige GPCR dyrket i et LCP matrise og fått sine høyoppløselige strukturer 6-9, med en betydelig redusert protein forbruket til under 0,3 mg per datasett. Injektoren består av et reservoar som kan holde opp til 20, 40 eller 100 ul krystall-laden LCP og en smal kapillær (10-50 mikrometer i diameter) gjennom som utvalget er ekstrudert ved anvendelse av høyt trykk (opp til 10 000 psi) fra en hydraulisk plunger med et trykk amplifisert trinn, drevet av en væske fra en HPLC (høy ytelse væskekromatografi) pumpe. Strømmen av LCP kommer ut av kapillaren dysen er stabilisert ved hjelp av en parallell strøm av ikke-reaktiv gass (typisk helium eller nitrogen).
Her gir vi visuelle demonstrasjoner av trinnene som er nødvendig for å forberede og karakterisere prøverfor en LCP-SFX eksperiment. Flere detaljer finner du i de publiserte protokoller 10. Som et eksempel, vil vi bruke adenosin A2A-reseptoren 11 og fremstille krystaller av dette proteinet i LCP for X-ray innsamling av data ved bruk av SFX tilnærming. Mens våre protokoller er kompatible med alle injektor stand til streaming LCP for datainnsamling ved serie krystallografi ved XFEL og synkrotron kilder, for illustrasjonsformål, vil vi bruke LCP injektoren beskrevet i Ref. 6. Optimalisert fellings forhold som produserer høy tetthet mikrokrystaller i LCP bør identifiseres med høy gjennomstrømming krystallisering screening 12,13 før du fortsetter til denne protokollen. Et typisk flytskjema for denne protokollen er vist i figur 1.
Protokollene er beskrevet her gi en generell oversikt over prøveopparbeidelse prosedyren for en standard LCP-SFX eksperiment med en LCP injektor. Basert på vår erfaring, den totale mengden av den endelige micro-laden LCP prøven som kreves for å samle en hel datasettet er vanligvis 50-100 pl (tabell 1; 25-50 mL av opprinnelig protein-laden LCP prøve), avhengig av micro størrelse , kvalitet og tetthet. Siden hver 100 ul gasstett glassprøyte kan romme omkring 7 ul av LCP i form av en fullt utstrakt streng for å sikre tilfredsstillende og til og med diffusjon av fellingsmiddeloppløsningen til LCP, bør i det minste fire til syv prøver i sprøyter fremstilles etter hver LCP-SFX eksperiment.
Ettersom prøven blir ekstrudert gjennom en smal 20-50 pm i diameter kapillar, er det avgjørende for å unngå eventuelle fremmedpartikkelformet materiale i prøven. Støv og fibre som kan tidvis introdusert i LCPprøve eller utfellingsmiddel oppløsninger kan tette injektoren kapillær og øke den ned-tiden i løpet av eksperimentet. Derfor er det viktig å filtrere lipid og alle løsninger gjennom et 5 um pore-filter før preparering av prøvene. Eventuelt kan et rent rom eller en bærbar clean room hetten brukes for prøveopparbeidelse.
Disse protokollene er basert på bruk av 9,9 MAG (monoolein) som vert lipid for MP krystallisering. De er imidlertid ikke begrenset til 9,9 MAG og kan enkelt tilpasses til andre LCP verts lipider eller lipid-blandinger etter å ha tatt hensyn til forskjellene i lipidfasen oppførsel. De fleste av de strukturer av parlamentsmedlemmer krystallisert i LCP ble oppnådd ved hjelp av en av magasiner, med 9,9 MAG å være den mest vellykkede representant så langt 15. Den største ulempen med å bruke 9,9 MAG for SFX er dens overgang til lamellær krystallfase ved avkjøling under 18 ° C, noe som ofte oppstår når datainnsamlingen blir utført i vakuum. den titratipå med 7.9 MAG beskrevet i kapittel 5 i denne protokollen gir en god løsning på dette problemet. I vår erfaring, krystaller tåle en slik titrering uten bivirkninger. Hvis det imidlertid ikke er ønskelig tilsetning av 7,9 MAG eller en annen kortkjedet MAG, kan titreringen utføres med 9,9 MAG. I dette tilfellet bør den gass som stabiliserer strømmen av LCP under injisering inn i vakuum slås fra helium til nitrogen, noe som kan hindre dannelsen av en krystallinsk lipidfase i de fleste prøver, på bekostning av å ha en mindre stabil prøvestrøm.
Den gel-lignende konsistens av LCP er en stor fordel for anvendelse som et krystall bærermedium, siden den tillater justering av krystallen strømningshastigheten over et bredt spekter, egnet for serie krystallografi datainnsamling ved moderne XFEL og synkrotron kilder. Matchende krystall strømningshastighet med XFEL puls etter hverandre fører til dramatisk reduksjon i krystall forbruk av størrelsesordener compared til flytende injeksjon. LCP er et egnet bæremedium for levering, ikke bare av MP-krystaller som dyrkes i den, men også for krystaller av oppløselige proteiner 21. Flere alternative viskøse krystall bære medier har nylig blitt introdusert 22-24, utvide arsenal av verktøy og reagenser for å gjennomføre serie krystallografi-eksperimenter. Videre har serie krystallografi med LCP som en krystall leveringsmedium blitt demonstrert ved konvensjonelle synkrotron kilder, i det minste for brønn-diffraksjon krystaller 24,25. Fremtidige oppgraderinger av synkrotron kilder som øker X-ray intensitet av størrelsesordener, samt forbedringer i detektorteknologi, vil gjøre serie krystallografi en enda mer tilgjengelig og attraktiv metode for strukturbestemmelse.
LCP-SFX har vist sin styrke for MP strukturbestemmelse. For utfordrende biologiske systemer (for eksempel GPCRs eller makromolekylære komplekser) hvor Large, diffraksjon kvalitet krystaller er vanskelig å vokse, kan LCP-SFX gi en attraktiv, om ikke den eneste, levedyktig alternativ for å løse en atom oppløsning struktur. Med alle sine fordeler, dvs. ved hjelp av LCP som matrise for MP krystallisering og krystall levering, lav protein forbruk, fravær av stråleskader, romtemperatur datainnsamling, muligheter for tids løst studier 26,27 og ingen krystall høsting krav, LCP- SFX bør spille en viktig rolle i fremtiden av strukturell biologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir R01 GM108635 og U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative Seed Grant Award og NSF STC pris 1231306. Vi takker A. Walker for å få hjelp med manuskriptet forberedelser.
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Nu Chek Prep | M239 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Sigma | M7765 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) | Nu Chek Prep | M219 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
LCP host lipid 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids | 850534 | Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection |
Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/mL | Target protein | ||
Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | Used to dissolve lipids |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-500ML | Used to wash syringes |
Eleven 100 mL Hamilton gas-tight syringes without needles | Hamilton | 7656-01 | For LCP preparation |
Eight syringe couplers | Hamilton | SKU 209526 | For LCP preparation |
Removable flat-tipped needle | Hamilton | 7804-01 | For LCP dispensing |
Parafilm | Parafilm | M', 250' x 2" | Used for syringe sealing |
Lint free lens cleaning tissues | Fisher | NC9592151 | |
Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 mL, Durapore 5 µm | Millipore | UFC3 0SV 00 | Used for filtering of precipitant solutions and lipids |
Microscope slides, 1 inch x 3 inch | GoldSeal | 3010 | |
Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol | VWR | 89094-640 | These are used to clean the syringes, needles and coupler. Methanol is used first, then water. |
Gloves | Microflex | XC-310-L | For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers |
Safety glasses | |||
Pressurized air cans | Office Depot (Dust-Off) | 527494 | For syringe cleaning |
Dry block heater with a digital temperature controller | Fisher | 11-720-10BQ | Used for thawing lipids |
Benchtop Centrifuge | Fisher | 05-413-340 | Spinning down solutions |
Clean Room Mini – 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter | Sentry Air Systems, Inc. | SS-112-PCR | Cleaning sample preparation |
Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer | Nikon | SMZ1500 | Crystal density check |
UV microscope | JAN Scientific | UVEX-P | Optional, for crystal imaging purposes |
SHG imager | Formulatrix | SONICC | Optional, for crystal imaging purposes |