PI (4,5) P2 reglerar olika cellulära funktioner, men dess nanoskala organisation i cellplasmamembranet är dåligt kända. Genom märkning PI (4,5) P2 med en dual-färg fluorescerande sond fuserad till pleckstrinhomologidomän beskriver vi en ny metod för att studera PI (4,5) P2 rymdfördelning i plasmamembranet på nanometerskala .
Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.
Fosfoinositider bidrar till en liten del av den totala membranlipider, men spelar kritiska roller i en mångfald cellulära processer. De omfattar sju medlemmar som härrör från reversibel fosforylering eller defosforylering av inositol ringar på den 3: e, 4: e och 5: e positionerna 1. Fosfatidylinositol 4-fosfat (PI4P) och fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) är två viktiga fosfoinositider som fungerar relativt oberoende som de avgörande lipider cellplasmamembran (PM) 2,3. Fosfatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) är mycket mindre riklig än PI4P och PI (4,5) P2, men det har unika funktioner i olika cellulära processer, inklusive cancer 4 och diabetes 5. Dessa lipider har molekylära interaktioner komplex med sina effektorer och många andra proteiner. Därför är det viktigt att förstå den rumsliga organisationen av dessa phosphoinositides i PM på nanometerskala.
Montera bevis har visat att proteinkomplex eller molekylkluster i de trånga PM områden kan fungera som signal hotspots 6. Till exempel, syntaxin 1a, ett nyckelprotein som reglerar membranfusion 7-9 visar klusterorganisation i PM. Skiljer sig från konsensussynen av klustret organisation syntaxin 1a, är den geografiska fördelningen av fosfoinositider i PM kontroversiell. Mönster PI (4,5) P2 utbredningsområde från enhetlig 10-12, stora fläckar 13,14 för att täta kluster 14-18, beroende på celltyper och experimentella metoder som används. Den rumsliga organisationen av PI (4,5) P2 vid högre upplösning är också inkonsekvent. En studie med stimulerad-utsläpp utarmning (STED) mikroskopi 19 har avslöjat ett stort antal tät PI (4,5) P 2 nanokluster (~ 73 nm i diameter) i PM ark PC-12-celler 20 </supp>. Detta resultat skiljer sig från studier med snabbfrysning elektronmikroskopi (EM) 21,22, en metod som bevarar den intakta PM strukturen av levande celler mycket bättre än kemisk fixering. Den senare visade tydliga pooler av PI (4,5) P2; relativt koncentrerad PI (4,5) P2 i caveolae och belagda gropar samt jämn fördelning på plan PM regionen. Dessutom kan nanoskala PI (4,5) P2 organisation i membran ark skiljer sig i levande och fixerade celler. Vårt senaste arbete undersökte denna fråga i både fasta och lever INS-1-celler med hjälp av en enda molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) 23.
SMLM baseras på stokastiskt inkoppling endast en liten delmängd av fluoroforer vid varje given tidpunkt, så att enskilda fluoroforer kan lokaliseras med hög precision. Många super-upplösning avbildning har utvecklats med hjälp av liknande principer att överträffa diffraktionsgränsen av konventionell Ijusmikroskopi, en sådans fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) 24, fluorescens fotoaktiverings lokalisering mikroskopi (FPALM) 25, stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM) 26,27 och direkt STORM (dSTORM) 28. Med fotoomkopplings eller fotoaktiverbara fluoroforer (färgämnen eller fluorescerande proteiner), SMLM tekniker tillåter forskare att bild biologiska strukturer på nanometerupplösning 24,29,30 med video-rate i levande celler 31,32.
Använda PI (4,5) P2 som ett exempel, introducerade vi SMLM strategi för att studera nanofördelningen fosfoinositider på PM. PH-domänen hos PLCδ1 (Fosfolipas C δ1) som specifikt binder till PI (4,5) P2 är en väletablerad sond för avbildning PI (4,5) P2 sub-cellulära distributionen och dynamik 33,34 i PM . Vi har genetiskt märkt denna domän med två fluorescerande proteiner, PAmCherry1 35 och iRFP 36 </sup> för att producera en tvåfärgad fusionsprotein (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (Figur 1A-B). PAmCherry1 tjänar som fotoaktiverbar prob av PH-domän för PALM och iRFP fungerar som en allmän indikator för att identifiera transfekterade celler innan PALM förvärvet . Vi tillämpar denna tvåfärgad fluorescerande prob för SMLM avbildning i de fasta membranblad. För levande PALM avbildning, märkt vi mEOS3 37 i stället för PAmCherry1 till PH PLCδ1 domänen för att generera mEOS3.1-PH PLCδ1 prob för dess bättre foton effektivitet och ljusstyrka (Figur 1C-D).
SMLM avbildning med dessa nya prober i PM av insulinproducerande INS-1-celler 38 har avslöjat homogen märkning av PI (4,5) P2 i de flesta PM regionerna samt koncentrerad PI (4,5) P2 mikrodomäner som är glest blandade i lägenheten PM och vissa filopodia liknande strukturer 23. Då ennoScale fördelning av PI (4,5) P2 ger en strukturell bas för nytänkande hur den fungerar i levande celler.
För felsökning, två processer behöver extra uppmärksamhet: membranplåtproduktionen och provfixering. Som beskrivs i protokollet, är viktigt för produktion membranark inkubationstiden av täck i steg 1.1.6. Optimala inkubationstiden under vårt experimentella tillstånd är 7-10 min (fig 2). Längre än 10 min inkubation kommer att producera intakta celler i stället för membran bladen på PDL täck och kortare inkubation kommer att leda till mindre eller ingen membran blad på PDL-belagda täck. Som beskrivs i protokollet, de fixerings och temperatur under fixering är avgörande för att upprätthålla PI (4,5) P2 fördelning i PM. Fixering vid RT eller användning av 4% -PFA ensam kunde snedvrida den normala lipid fördelningen i PM.
Genom att tillämpa PALM mikroskopi till membran Lipid Research, har vi möjlighet att observera nanometerskala distributionen av PI (4,5) P2, en nyckel fosfoinositid som förmedlar mnågra grundläggande cellulära aktiviteter. Denna geografiska fördelningen av PI (4,5) P2 med begränsade gradienter koncentrations i INS-1-celler ger en ram för nytänkande lipid-proteininteraktioner och lokala signaleringshändelser av PI (4,5) P2 i dessa celler. Dessutom kan de metoder som utvecklats i detta arbete också tillämpas på andra membranfosfolipid forskning med lämpliga prober, därmed erbjuda nya verktyg för att studera fosfoinositider i biologiska processer.
Användningen av membran ark i detta arbete förbi två stora problem i fosfolipid morfologiska studier: tvättmedel behandling och potentiell förorenings signal från cytosolen. Rengöringsmedel orsakar ofta klustring och betydande förlust av PM fosfolipid signal. Föroreningen av cytosoliska signal är särskilt problematiskt när det gäller låga förekomst fosfoinositider på PM 23, såsom PI (3,4,5) P3 och PI (3,4) P2. prov membranarket kan circumvent dessa problem utan att signifikant störa konstruktioner i samband med plasmamembranet, såsom kortikal aktin meshwork och clathrin-belagda gropar 42,43. Den relativa homogen fördelning av PI (4,5) P2 i PM är i god överensstämmelse med andra snabba frysning EM studier med användning av GST-PH PLC δ1 prober i fibroblast membranet 44.
Det är viktigt att notera att felaktiga provbearbetningsbetingelser kan generera missvisande resultat. För det första är det viktigt att utföra fixeringsstegen vid en lägre temperatur (4 ° C) och använda fixativ GA för produktion membranark. Såsom visas i fig 3, är varm temperatur och PFA fixering utan GA inte tillräcklig för att fixera fosfoinositider i cellen PM. Detta skulle kunna snedvrida den intakta PI (4,5) P2 distribution och generera skarpa kluster som inte observeras i levande celler under fysiologiska förhållanden. För det andra, användningen av PAmCherry1 somden SMLM sonden, snarare än andra sönder, är avgörande för kvantitativ PALM avbildning. Fördelen med PAmCherry1 ansökan kommer från dess väldefinierade enkla molekylära foto fysiska egenskaper 35,40,45, som ljusstyrka, hög effektivitet fotoaktivering och mest av allt, mycket begränsad foto blinka. Dessa egenskaper gör det möjligt för oss att eliminera potentiella kluster artefakter från foto blinka och kvantitativt analysera den molekylära tätheten av membran PI (4,5) P2.
Detta tillvägagångssätt har också sina begränsningar. Först kan membranet räkningsmetoden som används i denna studie inte helt härma den fysiologiska fördelningen av PI (4,5) P2 eftersom cellen bryts innan avbildning. Emellertid visar vår live PALM avbildning liknande relativt homogen fördelning av PI (4,5) P2, stödjer resultaten som observerats med prover membran ark. För det andra, som vi diskuterade i vårt tidigare arbete 23, kräver SMLM imaging kompetens och extra påsamhet att undvika avbildningsartefakter som kan uppstå från olika processer, inklusive sonderna som används, provberedning och fixering, bild sampling och rekonstruktion. Slutligen, även om PH-domänen baserade prober och antikroppar har använts i stor utsträckning i fosfoinositid studier 46,47 är det fortfarande möjligt att inte alla PI (4,5) P2 i membranet kan detekteras genom denna metod. Till exempel kan PI (4,5) P2 bunden av andra endogena proteiner inte vara tillgängliga för PH sönder eller antikroppar, och detta kan orsaka en underskattning av PI (4,5) P2 på grund av utrymmet hinder av sond sig. Ett alternativt sätt att märkning PI (4,5) P2 skulle användning av Top-Fluor PI (4,5) P2 48, en pre-märkt PI (4,5) P2-analog med en modifiering på svansen på original PI (4,5) P2. Emellertid kan den omvandlas snabbt till andra fosfoinositid subtyper av snabb levande cell metabolism eftersom dess inositolringen är samma som endogenous PI (4,5) P2. Detta väcker oro om detta i förväg märkt PI (4,5) P2 analog i levande celler troget kan representera PI (4,5) P2 snarare än dess metaboliska produkter. Därför, trots vissa begränsningar, PH domänbaserade prober är fortfarande bland de bästa sonder som har använts i stor utsträckning för att övervaka PI (4,5) P2 distribution och dynamik på PM av celler.
Den framtida tillämpningen av denna metod kan utvidgas till andra fosfoinositid studier, till exempel PI (3,4,5) P3 och PI (3,4) P2. Sammanfattningsvis, det nya SMLM metod som används här öppnar nya vägar för att studera fosfoinositid i celler. Använda PI (4,5) P2 som ett exempel, visar vi de unika egenskaperna hos PALM avbildning i morfologiska och kvantitativ studie av cellmembranmolekyler, liksom dess nackdelar. Detta tillvägagångssätt kan anpassas till andra molekyler av intresse och kommer att ha breda tillämpningar inom cellbiologi.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).
Microscope | Nikon | Ti-U | |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU X-1, 10,000 rpm | |
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. | Agilent | MLC400 | laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405nm: 15 mW & 13 mW; 488nm: 45 mW & 42 mW; 561nm: 45 mW & 40 mW; 640nm: 35 mW & 16 mW. |
100X Objective | Nikon | APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm | |
Nikon acquisition and analysis software(NIS Element) | Nikon | ||
Matlab | MathWorks | ||
Coverslip | Warner | 64-0714 | Round 18mm coverslip, #1.5 |
Fibronectin | Millipore | FC010-5MG | |
Lipofectamin 3000(transfection reagent) | Invitrogen | L3000-008 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | #16120 | |
PI(4,5)P2 1st antibody | Santa Cruz | sc-53412 | |
secondary antibody F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21237 | |
Tetraspeck beads | Invitrogen | T7279 | |
magnetic quick release imaging chamber | Warner Instruments | Cat#641994 | |
temperature controller | Warner Instruments | TC-344C | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417-100TAB | |
EGTA | Sigma | 3780 | |
NH4Cl | Sigma | A0171 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
CaCl2*2H2O | Sigma | 223506 | |
MgCl2*6H2O | Sigma | M9272 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Paraformaldyhyde | Sigma | P6148 |