Nya RNA-bindande proteiner Isolering av den snabba Methodology

Summary

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Abstract

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

Introduction

RNA-bindande proteiner (RBP-anordningama) utgör cirka 10% av S. cerevisiae proteiner ^1,2 och ca 15% av däggdjursproteiner ^3-5. De är inblandade i många cellulära processer såsom mRNA posttranskriptions bearbetning och reglering, översättning, ribosomen biogenes, tRNA aminoacylering och modifiering, kromatinremodellering och mer. En viktig undergrupp av RBP-anordningama är mRNA-bindande proteiner (mRNPs) ^6,7. Under mRNA mognad, olika RBP-anordningama binder avskriften och förmedla sitt nukleära bearbetning, export av kärnan, cellulär lokalisering, översättning och nedbrytning ^6-8. Således, den distinkta uppsättning av RBP-anordningama bundna till en viss utskrift vid någon tidpunkt bestämmer dess behandling och i slutändan dess öde.

Identifieringen av RBP-anordningama i samband med ett mRNA kan avsevärt förbättra vår förståelse av processer som ligger bakom deras post-transkriptionell reglering. skiftande genetisk, Mikroskopiska, biokemiska och bioinformatiska metoder har använts för att identifiera proteiner som är inblandade i mRNA-reglering (översikt i ^11/09). Men endast ett fåtal av dessa metoder gör det möjligt att identifiera proteiner associerade med ett särskilt mål mRNA. Att notera är jäst tre hybridsystem (Y3H), som utnyttjar mRNA av intresse som bete för att screena ett uttrycksbibliotek i jästceller. Positiva kloner observeras vanligtvis genom en tillväxt val eller reporter uttryck ^12-14. Den viktigaste fördelen med denna metod är den stora antal proteiner som kan skannas i en cellmiljö och förmågan att mäta styrkan av interaktion det RNA-proteinet. Nackdelar inkluderar det relativt stora antalet falska positiva resultat på grund av icke-specifik bindning och hög potential för falskt negativa resultat beror delvis på felveckning av fusionsproteinet byte eller betet RNA.

Ett alternativ till den genetiska tillvägagångssätt är affinitets purifiningen av RNA med sina associerade proteiner. Poly A-innehållande mRNA kan isoleras genom användning av oligo-dT kolonner, och deras associerade proteiner detekteras genom masspektrometri. interaktion RNA-proteinet är konserverad i dess cellulära sammanhang genom tvärbindning, vilket gör kortdistans kovalenta bindningar. Användningen av oligo dT kolumnen ger en överblick över hela proteomet som är associerad med någon poly A-innehållande mRNA ^3,5,15. Men detta inte ger en lista av proteiner som är associerade med en viss mRNA. Mycket få metoder är tillgängliga för att fullgöra en sådan identifiering. Paret Metoden innebär transfektion av nukleinsyra med komplementaritet till mål-mRNA ^16,17. Nukleinsyran är också kopplad till en peptid, som medger tvärbindning till RBP-anordningama i omedelbar närhet till den interaktionsställe. Efter tvärbindning, kan RBP-peptid-nukleinsyra isoleras och utsättas för proteomik analys. Nyligen var en aptamer baserad metodframgång tillämpas på extrakt från däggdjurscellinjer ^18. En RNA-aptamer med förbättrad affinitet till streptavidin utvecklades och fuserad till en sekvens av intresse (AU-rika element (ARE) i detta fall). Den aptamer-ARE-RNA fästes till streptavidinpärloma och blandas med cellysatet. Proteiner som är associerade med ARE-sekvensen renades och identifierades genom masspektrometri (MS). Även om denna metod upptäckt föreningar som sker utanför de cellulära inställningar (dvs in vitro), är det sannolikt att ändras i framtiden, så att införa aptamers i genomet och därigenom möjliggöra isolering av proteiner i samband med mRNA medan i cellulära miljön (dvs in vivo). I jäst, där genetiska manipulationer är väl etablerade, den snabba metoden (utvecklad i Prof. Jeff Gerst labb) ger en bild av in vivo föreningar ^19. RAPiD kombinerar den specifika och starka bindningen av MS2-höljeproteinet (MS2-CP) till MS2 RNA-sekvensen, och streptavidin-bindande domänen (SBP) till streptavidin konjugerade pärlor. Detta möjliggör effektiv rening av MS2-märkta mRNA genom streptavidinpärloma. Dessutom tillåter uttryck av 12 kopior av MS2 slingor upp till sex MS2-CPs att binda samtidigt till RNA och öka effektiviteten i sin isolering. Detta protokoll föreslogs därför att möjliggöra identifiering av nya mRNA-associerade proteiner när de eluerade proverna utsätts för proteomik analys med masspektrometri.

Vi nyligen utnyttjas Rapid för att identifiera nya proteiner som är associerade med jäst PMP1 mRNA ^20. PMP1 mRNA har tidigare visat sig vara associerade med ER-membranet och dess 3 'otranslaterade region (UTR) befanns vara en avgörande faktor i denna förening ^21. Således, RBP-anordningama som binder PMP1 3 'UTR kommer sannolikt att spela en viktig roll i dess lokalisering. RAPiD följt av vätskekromatografy-masspektrometri / masspektrometri (LC-MS / MS) resulterade i identifiering av många nya proteiner som interagerar med PMP1 ^20. Häri ger vi ett detaljerat protokoll av den snabba metoden, viktiga kontroller som behöver göras, och tekniska tips som kan förbättra avkastningen och specificitet.

Protocol

Obs: Sätt i en sekvens som består av 12 MS2-bindningsställen (MS2 loopar, MS2L) till den önskade genomiska locus, vanligtvis mellan den öppna läsramen (ORF) och 3 'UTR. En detaljerad protokoll för denna integration föreskrivs någon annanstans 22. Verifiera korrekt insättning och uttryck av PCR, Northern analys eller RT-PCR 20,23. Det är viktigt att kontrollera att integrationen inte ingripa med syntesen av 3'UTR. Dessutom bör en plasmid uttryckande MS2-CP fuserad till SBP under …

Representative Results

RAPiD möjliggör isoleringen av en specifik mål-RNA med sina associerade proteiner. Kritisk för dess framgång är att hålla det RNA intakt så mycket som möjligt, varigenom man erhåller en tillräcklig mängd proteiner. För att bestämma isolerings effektivitet och kvalitet av RNA, är northern analys (Figur 1A). Northern-analys har fördelen att direkt rapportera effektivitet och kvalitet Rapid. Sålunda kan de relativa mängderna av full längd och nedbrytnings…

Discussion

Olika metoder använder isolering av specifika mRNA för att identifiera sina associerade proteiner ^{11,34 35.} Dessa metoder tillämpas in vitro och in vivo strategier för att sondera RNA-proteininteraktioner. In vitro-metoder Inkubera exogent transkriberat RNA med cellysatet för att fånga RBP-anordningama och isolera RNP-komplex ^36,37. En effektiv metod av detta slag lades fram nyligen, som gjorde det möjligt att identifiera nya proteiner som binder en regl…

Materials

Tris	sigma	T1503
SDS	bio-lab	1981232300
DTT	sigma	D9779
Acidic Phenol (pH 4.3)	sigma	P4682
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)	sigma	P1944
Chloroform	bio-lab	3080521
Formaldehyde	Frutarom	5551820
Glycine	sigma	G7126
NP-40	Calbiochem	492016
Heparin	Sigma	H3393
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)	Sigma	P7626
Leupeptin	Sigma	L2884
Aprotinin	Sigma	A1153
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T9003
Pepstatin	Sigma	P5318
DNase I	Promega	M610A
Ribonuclease  Inhibitor	Takara	2313A
Glass Beads	Sartorius	BBI-8541701	0.4-0.6mm diameter
Mini BeadBeater	BioSpec	Mini BeadBeater 16
Guanidinium	Sigma	G4505
Avidin	Sigma	A9275
Streptavidin Beads	GE Healthcare	17-5113-01
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Yeast tRNA	Sigma	R8508
Biotin	Sigma	B4501
Yeast extract	Bacto	288620
peptone	Bacto	211677
Glucose	Sigma	G8270
1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)
0.2 M NaOH
4 x Laemmli Sample Buffer (LSB)			0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.
Hot phenol lysis buffer			10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS
3 M Sodium Acetate pH 5.2
100% and 70% Ethanol (EtOH)
RNase-free water
RaPID lysis buffer			20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease  Inhibitor.
2x Cross-linking reversal buffer			100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
RaPID wash buffer			20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit	Bio-Rad	161-0449	For detecting proteins in polyacrylamide gels
SD selective medium			1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)	Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)		1:5,000
Anti GFP antibody	Santa Cruz	sc-8334	1:3,000
Anti rabbit IgG-HRP conjugated	SIGMA	A9169	1:10,000