Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

Summary

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Abstract

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

Introduction

RNA-binding proteins (RBPs) rappresentano circa il 10% di S. proteine cerevisiae ^1,2 e circa il 15% delle proteine di mammiferi ^3-5. Essi sono implicati in molti processi cellulari, come l'elaborazione di mRNA post-trascrizionale e la regolamentazione, la traduzione, biogenesi dei ribosomi, tRNA aminoacilazione e la modifica, il rimodellamento della cromatina, e altro ancora. Un importante sottogruppo di RBPs è proteine mRNA-binding (mRNPs) ^6,7. Nel corso di mRNA maturazione diversi RBPs legano la trascrizione e mediare la sua lavorazione nucleare, l'esportazione fuori dal nucleo, localizzazione cellulare, la traduzione e la degradazione ^6-8. Così, la serie distinta di RBPs legati ad una particolare trascrizione in qualsiasi punto nel tempo determina la sua lavorazione e, infine, il suo destino.

L'identificazione di RBPs associati ad un mRNA potrebbe migliorare significativamente la nostra comprensione dei processi sottostanti la loro regolazione post-trascrizionale. Diverse genetica, Microscopiche metodi biochimici e bioinformatica sono stati utilizzati per identificare le proteine coinvolte nella regolazione di mRNA (rivisto in ^9-11). Tuttavia, solo alcuni di questi metodi consentono l'identificazione di proteine ​​associate con un particolare mRNA bersaglio. Da segnalare è l'ibrido sistema di lievito Three (Y3H), che utilizza l'mRNA di interesse come esca per lo screening di una libreria di espressione in cellule di lievito. Cloni positivi si osservano di solito attraverso una selezione di crescita o giornalista espressione ^12-14. Il vantaggio principale di questo metodo è il gran numero di proteine ​​che possono essere scansionate in un ambiente cellulare e la capacità di misurare la forza dell'interazione RNA-proteina. Svantaggi includono il numero relativamente elevato di falsi positivi a causa di legame non specifico, e l'elevato potenziale di risultati falsi negativi dovuti, in parte, al ripiegamento della preda proteina di fusione o l'RNA esca.

Un'alternativa all'approccio genetico è purifi affinitàcazione di RNA con le sue proteine ​​associate. Poly A contenente mRNA può essere isolato mediante l'uso di oligo dT colonne, e le loro proteine ​​associate vengono rilevati mediante spettrometria di massa. L'interazione RNA-proteina è conservata nel suo contesto cellulare da reticolazione, che rende legami covalenti a corto raggio. L'uso della colonna dT oligo produce una visione globale dell'intero proteoma che è associato con qualsiasi poli A contenente mRNA ^3,5,15. Tuttavia, questo non fornisce un elenco di proteine ​​che sono associati a un particolare mRNA. Molto pochi metodi sono disponibili per realizzare una tale identificazione. Il metodo COPPIA comporta la transfezione di acido nucleico con complementarità al bersaglio mRNA ^16,17. L'acido nucleico è anche collegato ad un peptide, che consente di reticolazione RBPs nelle immediate vicinanze del sito di interazione. Dopo la reticolazione, l'acido RBP-peptide-nucleico può essere isolato e sottoposto ad analisi proteomica. Di recente, una metodologia basata su aptamero eraefficacemente applicato ad estratti da linee cellulari di mammiferi ^18. Un aptamero RNA con una maggiore affinità con streptavidina è stato sviluppato e fusa ad una sequenza di interesse (elemento ricco di AU (ARE) in questo caso). Il aptameri-ARE RNA è stata allegata al perline streptavidina e mescolato con lisato cellulare. Le proteine ​​che associate con la sequenza ARE sono stati purificati e identificati mediante spettrometria di massa (MS). Anche se questo metodo rilevato associazioni che si verificano all'esterno le impostazioni cellulari (cioè, in vitro), è probabile essere modificato in futuro in modo da introdurre aptameri nel genoma e consentire così l'isolamento di proteine associate con il mRNA mentre nel ambiente cellulare (cioè, in vivo). In lievito, in cui le manipolazioni genetiche sono ben stabiliti, il metodo rapido (sviluppato nel laboratorio del Prof. Jeff Gerst) fornisce una visualizzazione di vivo associazioni in ^19. RaPID combina la specifica e forte legame della proteina di rivestimento MS2 (MS2-CP) alla sequenza RNA MS2, e del dominio di legame streptavidina-(SBP) di streptavidina microsfere coniugate. In questo modo efficiente purificazione di mRNA MS2-taggate con perline streptavidina. Inoltre, l'espressione di 12 copie MS2 loop consente fino a sei MS2-CP di impegnare contemporaneamente al RNA e aumentare l'efficienza del suo isolamento. Questo protocollo è stato quindi suggerito di consentire l'identificazione di nuove proteine ​​mRNA associate una volta che i campioni eluiti vengono sottoposti ad analisi proteomica mediante spettrometria di massa.

Recentemente abbiamo utilizzato rapide per identificare nuovi proteine associate con il lievito PMP1 mRNA ^20. PMP1 mRNA è stato precedentemente dimostrato di essere associato con la membrana ER e la sua regione 3 'non tradotta (UTR) è stato trovato per essere un elemento determinante in questa associazione ^21. Così, RBPs che legano PMP1 3 'UTR sono suscettibili di svolgere un ruolo importante nella sua localizzazione. RaPID seguito da cromatografo liquidoy-spettrometria di massa / spettrometria di massa (LC-MS / MS) ha portato all'identificazione di numerose nuove proteine che interagiscono con PMP1 ^20. Qui, forniamo un protocollo dettagliato della metodologia rapida e controlli importanti che devono essere fatte, e suggerimenti tecnici che possono migliorare il rendimento e la specificità.

Protocol

Nota: inserire una sequenza composta da 12 siti MS2-assorbente (MS2 loop; MS2L) nel locus genomico desiderato, di solito tra la griglia di lettura aperta (ORF) e il 3 'UTR. Un protocollo dettagliato per questa integrazione è fornito altrove 22. Verificare il corretto inserimento e di espressione mediante PCR, analisi Northern o RT-PCR 20,23. È importante verificare che l'integrazione non è intervenuto con la sintesi del 3'UTR. Inoltre, un plasmide esprimente MS2-CP fuso SBP sotto l&#…

Representative Results

RaPID consente l'isolamento di uno specifico RNA bersaglio con le sue proteine ​​associate. Critico per il successo è mantenere l'RNA intatto il più possibile, ottenendo una quantità sufficiente di proteine. Per determinare l'efficienza di isolamento e la qualità dell'RNA, analisi Northern viene eseguita (Figura 1A). analisi Northern ha il vantaggio di segnalazione direttamente l'efficienza e la qualità della RaPID. Così, le quantità relati…

Discussion

Vari metodi utilizzano l'isolamento di mRNA specifici per identificare le loro proteine associate ^{11,34 35.} Questi metodi si applicano in vitro e in vivo strategie per sondare le interazioni RNA-proteina. Metodi in vitro incubare esogena trascritti di RNA con lisato cellulare per catturare RBPs e isolare complessi RNP ^36,37. Un approccio efficace di questo tipo è stato presentato di recente, che ha permesso l'identificazione di nuove proteine che legan…

Materials

Tris	sigma	T1503
SDS	bio-lab	1981232300
DTT	sigma	D9779
Acidic Phenol (pH 4.3)	sigma	P4682
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)	sigma	P1944
Chloroform	bio-lab	3080521
Formaldehyde	Frutarom	5551820
Glycine	sigma	G7126
NP-40	Calbiochem	492016
Heparin	Sigma	H3393
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)	Sigma	P7626
Leupeptin	Sigma	L2884
Aprotinin	Sigma	A1153
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T9003
Pepstatin	Sigma	P5318
DNase I	Promega	M610A
Ribonuclease  Inhibitor	Takara	2313A
Glass Beads	Sartorius	BBI-8541701	0.4-0.6mm diameter
Mini BeadBeater	BioSpec	Mini BeadBeater 16
Guanidinium	Sigma	G4505
Avidin	Sigma	A9275
Streptavidin Beads	GE Healthcare	17-5113-01
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Yeast tRNA	Sigma	R8508
Biotin	Sigma	B4501
Yeast extract	Bacto	288620
peptone	Bacto	211677
Glucose	Sigma	G8270
1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)
0.2 M NaOH
4 x Laemmli Sample Buffer (LSB)			0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.
Hot phenol lysis buffer			10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS
3 M Sodium Acetate pH 5.2
100% and 70% Ethanol (EtOH)
RNase-free water
RaPID lysis buffer			20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease  Inhibitor.
2x Cross-linking reversal buffer			100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
RaPID wash buffer			20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit	Bio-Rad	161-0449	For detecting proteins in polyacrylamide gels
SD selective medium			1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)	Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)		1:5,000
Anti GFP antibody	Santa Cruz	sc-8334	1:3,000
Anti rabbit IgG-HRP conjugated	SIGMA	A9169	1:10,000