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Genetics

विलय निरपेक्ष और सापेक्ष मात्रात्मक पीसीआर डेटा Stat3 ब्याह संस्करण देखिए यों

Published: October 09, 2016
doi:
10.3791/54473
, , ,
1Department of Biomolecular Chemistry,University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine,University of Wisconsin-Madison

Summary

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and α/β C-termini, can be quantified.

Abstract

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (ΔS) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (α) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (β). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3‘s four spliced transcripts (Sα, Sβ, ΔSα and ΔSβ) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants’ levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Introduction

शॉर्ट रेंज (मिलकर) वैकल्पिक splicing है, जहां वैकल्पिक स्वीकर्ता या दाता साइटों एक दूसरे के करीब निकटता में हैं, स्तनधारियों 1, 2 अकशेरुकी और पौधों 3 में आम है। यह अनुमान है कि स्तनधारी जीन के 20% वैकल्पिक ब्याह साइटों के अलावा 2-12 न्यूक्लियोटाइड 4 होते हैं। इन साइटों में से कई 3 न्यूक्लियोटाइड अलग कर रहे हैं और शामिल किए जाने या एक ही कोडोन के बहिष्कार में परिणाम। इन साइटों 5,6 कुछ बहस के साथ कम से splicing नियमन की प्रकृति के बारे में बहस है कि splicing मूल भाव मतभेद, इतना सूक्ष्म है कि चयन स्टोकेस्टिक 7 हैं, जबकि अन्य ऊतक विशिष्टता 8 के आधार पर नियमन अनुमान है।

मिलकर ब्याह साइट चयन विश्लेषण किया गया है अर्द्ध मात्रात्मक संशोधित केशिका वैद्युतकणसंचलन 7, और उच्च संकल्प जेल वैद्युतकणसंचलन 8 का उपयोग। शाही सेना Seq (आरएनए अनुक्रमण) पढ़ता प्रत्येक ब्याह में splicing के अनुपात में यों इस्तेमाल किया जा सकता हैसाइट। इस तरह, शाही सेना Seq डेटा मिलकर ब्याह साइटों 9 के नियमन के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान की गई है। यह भी उम्मीद ब्याह संस्करण न्यूक्लियोटाइड मूल भाव 10 अनुपात के आधार पर की भविष्यवाणी के लिए सक्षम है। भी शामिल है कि या शामिल नहीं है एक भी कोडोन और आमतौर पर होने वाली मिलकर स्वीकर्ता ब्याह साइटों, NAGNAGs (जहां एन किसी भी न्यूक्लियोटाइड =) के रूप में जाना जाता है पर किया गया है splicing पर जोर देने के अधिकांश।

मिलकर दाता वैकल्पिक ब्याह सहित या (GYNGYN मान्यता आकृति, जहां वाई = pyrimidine) एक एकल कोडोन छोड़कर साइटों मिलकर स्वीकारकर्ताओं से कम आम हैं। सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन 3 (Stat3) का उत्प्रेरक मिलकर दाता वैकल्पिक splicing 1,11 दौर से गुजर रहा एक महत्वपूर्ण जीन है। मिलकर दाता ब्याह साइटों एक्सॉनों 21 और 22 में शामिल होने और सेरीन-701 (S या ΔS क्रमशः) 1,11 के लिए शामिल किए जाने या कोडोन के बहिष्कार में परिणाम। डाउनस्ट्रीम विकल्प स्वीकर्ता साइटों (एक दूसरे से 40 न्यूक्लियोटाइड के अलावा) में शामिल होने एक्सॉनों 22 औरTransactivation डोमेन (α) या 7 अनोखी सी टर्मिनल अवशेषों (β) 11 के साथ एक छोटा transactivation डोमेन के दोनों 55 टर्मिनल अवशेषों के शामिल किए जाने में 23A / बी नतीजा है। इसलिए, चार ब्याह वेरिएंट संभव हो रहे हैं।

Stat3 प्रोटीन एक प्रतिलेखन कारक है और कई प्रकार की कोशिकाओं के 12 में प्रमुख संकेत करनेवाला है और जब उत्परिवर्तित अपने विधान सक्रियण कई कैंसर phenotypes (संदर्भ 13 में समीक्षा) के लिए योगदान देता है। अय्यूब के सिंड्रोम, एक इम्यूनो विकार आईजीई का उच्च स्तर की विशेषता है, यह भी Stat3 में परिवर्तन के कारण होता है (संदर्भ 14 में समीक्षा)। Stat3 α और β ब्याह संस्करण प्रोटीन के लिए अलग भूमिकाओं के पहले किया गया है 15 में वर्णित है। प्रारंभ में, Stat3 β एक प्रमुख नकारात्मक ढंग से 16 में कार्य करने के लिए, Stat3 α के transcriptional गतिविधि को नाराज करने के बारे में सोचा था, लेकिन बाद में काम सुझाव यह स्वतंत्र लक्ष्य जीन 17 है </s> अप। मिलकर splicing की सूक्ष्मता के बावजूद, वहाँ अभाव या सेरीन-701 (Ser701) प्रभावों समारोह की उपस्थिति पर विश्वास करने का कारण है। इतना ही नहीं Ser701 tyrosine-705 (छाछ Stat3 सक्रियण 18 में phosphorylated) के करीब निकटता में है, लेकिन हाल ही में एक अध्ययन से पता चलता है कि Stat3 एस और ΔS ब्याह वेरिएंट दोनों आवश्यक Stat3 आदी फैलाना बड़े बी सेल लिंफोमा (DLBLCL) की व्यवहार्यता के लिए हैं 19 कोशिकाओं। जैविक प्रासंगिकता का पता लगाया जाना बाकी है। यह देखते हुए कि ब्याह संस्करण रचना समारोह को प्रभावित कर सकता है, हम है कि क्या अनुपात eosinophils में साइटोकाइन उत्तेजना से परेशान था की खोज करने का प्रयास किया।

हम शुरू में Stat3 α और β ब्याह वेरिएंट के लिए पीसीआर विशिष्ट, एक प्रतिबंध के साथ उत्पादों की दरार द्वारा बाद का उपयोग एस ब्याह वेरिएंट, AfeI के लिए विशेष एंजाइम द्वारा दो splicing घटनाओं के बीच संबंध का पता लगाने का प्रयास किया। उत्पादों की densitometry शामिल किए जाने के संकेत Ser701 r थाoughly दस गुना अधिक अपनी चूक (ΔS) दोनों Stat3 α और β की तुलना में आम (डेटा) नहीं दिखाया। हालांकि, इस अर्द्ध मात्रात्मक दृष्टिकोण पर्याप्त प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं था, और प्रभावी ढंग से इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है मापने के लिए सभी चार ब्याह एक साथ वेरिएंट। चार ब्याह वेरिएंट में से प्रत्येक के अनुपात का विश्लेषण करने के लिए, यह एक मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) प्रोटोकॉल है कि तंग तकनीकी (किसी नमूने के कई assays) झुकेंगे स्थापित करने के लिए जरूरी हो गया था दोहराता है।

सापेक्ष qPCR एक मानक या गृह व्यवस्था एक विशेष स्तर 20 में व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है जीन के लिए ब्याज की एक जीन की तुलना पर निर्भर करता है और उचित है जब ब्याज और गृह व्यवस्था जीन की जीन समान दक्षता के साथ परिलक्षित कर रहे हैं। एक डबल असहाय (डी एस) डीएनए बाध्यकारी फ्लोरोसेंट (जाती) डाई पीसीआर amplicons 21 को बांधता है, और चक्र का एक निश्चित संख्या के बाद, पर्याप्त प्रवर्धन प्रतिदीप्ति के लिए हुआ है detectable होने के लिए। उच्च प्रारंभिक स्तरप्रतिलिपि के, कम सीमा चक्र (सीटी) मूल्य। चूंकि सीडीएनए तैयारियों की एकाग्रता अलग है, एक eosinophils 22 में एक प्रतिलिपि सभी नमूनों में लगातार स्तर पर व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है, glucuronidase-β (GUSB) की तरह की एकाग्रता के साथ प्रतिलेख की एकाग्रता की तुलना करने की जरूरत है।

सापेक्ष qPCR मिलकर splicing से उत्पन्न ब्याह वेरिएंट के रूप में देखा, अत्यधिक इसी तरह के दृश्यों के लिए संभव नहीं है। कड़े विशेष रूप से ब्याह वेरिएंट बढ़ाना आवश्यक शर्तों में कमी आई दक्षता में परिणाम। इसके बजाय, पूर्ण मात्रा का ठहराव 23 इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यह ब्याज की spliced प्रतिलेख के ज्ञात सांद्रता के साथ एक मानक वक्र तैयारी ठीक करता है, और यह सुनिश्चित करना पीसीआर की स्थिति विशिष्टता 24 अनुकूलन। के रूप में वर्णित है, एक विशेष जीन के लिए निरपेक्ष और सापेक्ष qPCR डेटा एक विशेष सेल प्रकार में जीन की अभिव्यक्ति की समझ को सूचित करने में विलय किया जा सकताविभिन्न प्रेरित eosinophils 25 में इस मामले Stat3।

इस के साथ साथ, Stat3 ब्याह संस्करण मात्रा का ठहराव उम्मीद है कि विधि अन्य संगठनों ने मिलकर splicing घटनाओं के लक्षित पढ़ाई के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के साथ वर्णन किया गया है। अनुकूलन एक लंबी प्रक्रिया है, जहां विभिन्न सांद्रता और साइकिल चालन के मापदंडों के कई पुनरावृत्तियों में कई प्राइमर जोड़े में कुछ महीने के कोर्स पर परीक्षण किया गया था। प्रोटोकॉल की प्रमुख विशेषताओं में प्राइमर विशिष्टता सत्यापन और मात्रा का ठहराव ब्याह वेरिएंट के ज्ञात सांद्रता के साथ मानक घटता के आधार पर कर रहे हैं। संयोजन के रूप में सापेक्ष qPCR हमारे आवेदन के लिए मददगार साबित हुआ है, लेकिन जरूरी नहीं है।

Protocol

नोट: परिधीय रक्त eosinophils के साथ एक प्रोटोकॉल को मंजूरी दी (# 2013-1570) स्वास्थ्य विज्ञान संस्थागत समीक्षा बोर्ड के लिए विस्कॉन्सिन-मैडिसन सेंटर के विश्वविद्यालय द्वारा समझौते में जानकारी की पहचान के बिना प्राप्त हुए थे। दाता से सूचित सहमति पर हस्ताक्षर किए शोध में प्रत्येक नमूना के उपयोग के लिए प्राप्त हुई थी। 1. खाका मानक के रूप में प्लास्मिड बनाना एक amplicon दोनों Stat3 ब्याह साइटों फैले लिए प्राइमरों बनाएँ, 5'- KpnI और NheI प्रतिबंध साइटों (और 5'-एक्सटेंशन) टेबल 1 ए के अनुसार के साथ। नोट: KpnI और NheI साइटों सम्मिलित सक्षम करने के लिए चुने गए हैं केनामाइसिन प्रतिरोध 25,26 के साथ एक संशोधित पीईटी-28A वेक्टर में ligated जा करने के लिए KpnI साइट कई क्लोनिंग साइट में जोड़ दिया गया था।। हौसले का दान eosinophils का प्रयोग, सेल संस्कृति माध्यम में 2.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के नकली नमूने तैयार (रोसवेल पार्क मेमोरीएल संस्थान (RPMI) 1640 मध्यम)। 5% सीओ 2 और 10% आर्द्रता के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। शाही सेना निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार (तैयारी अनुसार कम से कम 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं) के नमूनों से पूरक (ग) डीएनए तैयार करें। टेम्पलेट सीडीएनए कदम 1.2.1 में तैयार से, बढ़ाना Stat3 ब्याह टेबल 2A के अनुसार प्रवर्धन पीसीआर का उपयोग वेरिएंट। में 2% agarose Tris- एसीटेट-ethylenediaminetetraacetate (TAE) जेल 27 amplicons संकल्प। जेल से आबकारी बैंड और जेल छांटना किट निर्देशों के अनुसार शुद्ध। कट amplicons और उचित प्रतिबंध एंजाइमों (संदर्भ 27 में प्रतिबंध का अवलोकन), वॉल्यूम्स, ऊष्मायन समय और तापमान का उपयोग कर के साथ प्लाज्मिड एंजाइम प्रदाता द्वारा सिफारिश की; और 1.4 चरण में के रूप में शुद्ध। प्रदाता की सिफारिश की शर्तों के तहत प्लाज्मिड में प्रतिबंधित amplicons ligate। एक नकारात्मक शेष भाग को तैयारROL (डालने के बिना, लेकिन ligase के साथ प्रतिबंधित प्लास्मिड डीएनए) और एक सकारात्मक नियंत्रण (केनामाइसिन प्रतिरोध के साथ अप्रतिबंधित प्लाज्मिड)। सक्षम ई के मानक प्लाज्मिड परिवर्तनों प्रदर्शन कोलाई DH5α 28 बंधाव मिश्रण का उपयोग करते हुए 27। सेते तब्दील ई 1 मिलीलीटर Luria-शोरबा (पौंड) के माध्यम में कोली (निर्देश दिए 27 के रूप में तैयार) 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मिलाते हुए। जिसमें 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते लेग प्लेटों पर बिखरा हुआ है transformants। Stat3 α और Stat3 β प्लेटों बाँझ toothpicks 27 का उपयोग करने से कई कालोनियों उठाओ। 2 मिलीलीटर लेग करने के लिए प्रत्येक हस्तांतरण एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृतियों आगे बढ़ें। एक डीएनए शुद्धि किट में दिए गए निर्देशों का पालन करके बैक्टीरियल संस्कृतियों से plasmids शुद्ध। -20 या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर plasmids। 20 μl अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं को तैयार करने से कई कालोनियों से अनुक्रम plasmids। पिपेट 3μl अनुक्रमण प्रतिक्रिया बफर, 2 μl अनुक्रमण प्रतिक्रिया मिश्रण, 12 μl ultrapure पानी, टेम्पलेट और 2 μl अनुक्रमण किताब के रूप में 1 μl प्लाज्मिड। नोट: पालतू पशु-28A सदिश का उपयोग करते हैं, तो अनुक्रमण प्राइमर 5'-TAA टीएसी जीएसी टीसीए सीटीए टैग GGG-3 उपयोग '। Sα, Sβ, ΔSα और ΔSβ 25: plasmids प्रत्येक संस्करण एन्कोडिंग के electrophoretograms का आकलन करें। एनजी / μl में शुद्ध प्लास्मिड डीएनए के उपाय एकाग्रता। तो 260 एनएम पर absorbance पढ़ने एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग, बीयर-लैम्बर्ट कानून 29 का उपयोग डीएनए एकाग्रता की गणना: जहां सी = एकाग्रता, एक = absorbance, ε (विलुप्त होने के गुणांक) = 0.02 (माइक्रोग्राम / एमएल) -1 सेमी -1 प्रकाश की डबल असहाय डीएनए और एल = पथ की लंबाई (आमतौर पर 1 सेमी) के लिए। Stat3 ब्याह संस्करण सीडीएनए बजे की आणविक वजन का उपयोगplicons और वेक्टर, μl प्रति प्रतिलिपि संख्या की गणना। नोट: आधार जोड़ी प्रति आण्विक वजन (बीपी) के रूप में 650 दा अनुमान लगाया गया है। 2. निरपेक्ष qPCR के लिए प्राइमर विशिष्टता का विश्लेषण Μl प्रति ~ 10 8 करने के लिए 10 3 प्रतियां (20 μl) ultrapure पानी का उपयोग कर के साथ, Stat3 plasmids के 10 कमजोर पड़ने श्रृंखला में 1 तैयार करें। सबसे केंद्रित का उपाय एकाग्रता (~ 10 8 μl प्रति प्रतियां, कदम 1.11 देखें)। पतला plasmids का प्रयोग चार "गैर लक्ष्य" घोला जा सकता है तैयार करने के लिए (यानी।, Stat3 ΔSβ नकारात्मक Stat3 Sα, ΔSα, Sβ लेकिन कोई ΔSβ के बराबर सांद्रता वाले नियंत्रण) प्रत्येक μl प्रति 10 6 प्रतियों पर। Μl प्रति 10 6 प्रतियों में सभी चार टेम्पलेट्स प्रत्येक के बराबर सांद्रता के साथ एक "लक्ष्य" मिश्रण तैयार करें। प्राइमर जोड़ी समाधान तैयारप्रत्येक ब्याह संस्करण के लिए एक 7 सुक्ष्ममापी एकाग्रता में प्राइमरों प्रत्येक के 60 μl (तालिका 1 बी और चित्रा 1 देखें) बनाकर ~ (नमूने में अंतिम एकाग्रता 560 एनएम) हो जाएगा। शुद्ध एच 2 ओ के साथ 5: डीएनए पोलीमरेज़ / dsDNA बाध्यकारी डाई मिश्रण 7 पतला के रूप में टेम्पलेट (3 टेबल) में दिखाया गया एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में परख 1 सेट करें। 21 μl पतला डीएनए पोलीमरेज़ / dsDNA बाध्यकारी डाई मिश्रण जोड़ें, तो प्राइमर मिश्रण के 2 μl और टेम्पलेट के 2 μl (प्रति तालिका के रूप में 2 बी)। टेम्पलेट के बजाय, 2 μl कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) अच्छी तरह से करने के लिए फ़िल्टर एच 2 ओ जोड़ें। दो प्रतियों में प्रतिक्रियाओं सेट अप repeatability 30 का आकलन करने के लिए। चिपकने वाला कवर और 12 डिग्री सेल्सियस पर 1,200 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के साथ सील qPCR थाली। सामग्री पर सूचीबद्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हैं, के रूप में वर्णित प्रयोग की स्थापना की। qPCR मशीन और डालने को चालू qPCR थाली सील कर दिया। फ़ाइल क्लिक करें और# 62; नई> अगला>, "नई डिटेक्टर" का चयन करें संवाददाता चुनते हैं, पेय और नाम प्रदान करते हैं। प्रत्येक ब्याह संस्करण के लिए एक 'नई डिटेक्टर "सेट करें। अगला का चयन करें और सेट अप नमूना थाली पेज पर कहा जाए, के रूप में मानकों की स्थापना की, मात्रा सुनिश्चित तालिका में प्रवेश कर रहे हैं और उचित डिटेक्टरों चुने गए हैं। समाप्त क्लिक करें। टेबल 2 बी के अनुसार साइकिल सेट करें। कि प्रतिदीप्ति सुनिश्चित पढ़ने (सीटी निर्धारित करने के लिए) प्रत्येक चक्र के 72 डिग्री सेल्सियस कदम के दौरान होता है। भागो का चयन करें। जब रन पूरा हो गया है, परिणाम टैब> प्रवर्धन साजिश टैब पर क्लिक करें। मूल्यांकन उत्पादन प्रवर्धन साजिश डेटा की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए (एक घातीय साजिश के लिए लग रही है, चित्रा 2 के रूप में)। नोट: यह सुनिश्चित करें प्रवर्धन भूखंडों ज्यादातर घातीय और उस चक्र सीमा साजिश का तेजी से भाग में स्थापित किया जा सकता हैं। सुनिश्चित करें NTCs परिलक्षित नहीं कर रहे हैं और अन्य मानक अंक एक उच्च ΔRn के साथ एक कम सीटी मूल्य प्रदर्शित करता है। विस्तार करने के लिएort स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के लिए यह परिणाम है, क्लिक करें फ़ाइल> निर्यात> परिणाम। 3. निरपेक्ष qPCR परख विशिष्टता और Repeatability का आकलन repeatability सीटी के मानक विचलन मूल्यों (प्रतिदीप्ति के लिए सीमा चक्र) की गणना करने के लिए कदम 2.7.5 से डेटा का उपयोग करें। जहाँ n = नमूनों की संख्या (2 यदि दो प्रतियों में किया जाता है), = नमूना की सीटी और = नमूना सीटी मतलब है। जाँच करें कि डुप्लिकेट की सीटी मूल्यों के मानक विचलन ≤0.2 है। जाँच करें कि सभी लेकिन एनटीसी कुओं में सीटी मूल्यों 38 से छोटे हैं। अगर repeatability या तो बढ़ाने या कम annealing समय से गरीब अनुकूलन साइकिल चालन के मापदंडों है। प्लॉट लॉग प्रतिलिपि सुन्नईआर (के रूप में कदम 1.12 में चुना गया है और 2.1 चरण में तैयार) बनाम सीटी मूल्य एक मानक वक्र बनाने के लिए; उपज निम्न समीकरण: जहां y सीटी है, मी ढाल है, एक्स लॉग (प्रतिलिपि संख्या) है और ख अवरोधन मूल्य है। नोट: रेखीय प्रतिगमन के आर 2 अच्छा मूल्य डेटा के लिए ≥0.95 होगा। मानक वक्र और समीकरण का उपयोग प्रवर्धन दक्षता की गणना: नोट: दक्षता ≥75% के लिए निशाना लगाओ। भी सूत्र का उपयोग qPCR परख 1 से विशिष्टता की गणना: कहाँ Δ सीटी बहुत = सीटी लक्ष्य – सीटी गैर लक्ष्य, विशिष्ट और गैर विशिष्ट amp के लिए सीमा चक्र संख्या में अंतर का वर्णनlification नोट: विशिष्टता परिमाण के चार आदेशों से अधिक होना चाहिए (यानी, विशिष्टता कारक ≥4।)। अगर विशिष्टता गरीब है, प्राइमर एकाग्रता को कम से अनुकूलन। अंतिम प्राइमर 100 एनएम से 500 एनएम को लेकर सांद्रता के साथ (कदम 2.5-2.7 में वर्णित) assays के सेट करें। 4. सापेक्ष qPCR assays के प्रदर्शन साइटोकिन्स ट्रांसक्रिप्शन बढ़ावा देने के साथ कोशिकाओं का इलाज। हौसले का दान eosinophils के लिए, 2.5 x 10 6 कोशिकाओं / सेल संस्कृति माध्यम में मिलीलीटर (1640 RPMI मध्यम) के नकली नमूने तैयार करने और 50 एनजी / एमएल इंटरल्यूकिन 3 (IL3) और / या 50 एनजी / एमएल ट्यूमर परिगलन कारक α के साथ इलाज ( TNFα) 5% सीओ 2 और 10% आर्द्रता के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 3, 6, 9 और 20 घंटे की अवधि के लिए। शाही सेना निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार Eosinophil नमूने (तैयारी अनुसार कम से कम 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं) से सीडीएनए तैयार करें। </li> "1024 1 में" कमजोर पड़ने "1" से एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के साथ करने के लिए, दो नमूने सीडीएनए aliquots (नियंत्रण या आराम नमूने) के धारावाहिक dilutions तैयार करें। 4 कमजोर पड़ने में 1, पिपेट 1 μl सीडीएनए और 3 μl ultrapure पानी के लिए। 16 में 1 कमजोर पड़ने के लिए, पिपेट 1 से 4 के कमजोर पड़ने और 3 μl ultrapure पानी, आदि में 1 की μl वर्णित चरणों 2.3-2.5 रूप में, लेकिन पैन Stat3 और GUSB (तालिका 4 में टेम्पलेट देखें) के लिए कई प्राइमर सांद्रता के साथ 25 μl प्रतिक्रियाओं के साथ 96 अच्छी तरह से थाली में पीसीआर को निर्धारित करें। GUSB के लिए 'नई डिटेक्टर "जोड़ें और कदम 2.6-2.7 का पालन करें, टेबल -2 सी में वर्णित साइकिल चालन के मापदंडों का उपयोग कर। मानक घटता निर्धारित करने के लिए जो प्राइमर सांद्रता 95-100% प्रवर्धन दक्षता में परिणाम (कदम 3.2 और 3.3 देखें) उत्पन्न करता है। (4.2 कदम से) तैयार सीडीएनए नमूने और अनुकूलित प्राइमर सांद्रता के साथ थाली सेट अप(साइकिल चालन के मापदंडों, अभिकर्मकों और टेबल 5 96 अच्छी तरह से थाली टेम्पलेट के लिए तालिका -2 सी देखें)। कदम 2.6-2.7 प्रदर्शन करना। दोहराएँ परख कम से कम एक बार और डेटा की गुणवत्ता की जाँच करें। दोनों Stat3 और गृह व्यवस्था जीन GUSB के लिए डुप्लिकेट नमूना सीटीएस की औसत सीटी मूल्य की गणना। प्रत्येक नमूना के लिए प्राप्त Δ सीटी मूल्यों। आराम नमूना नामित नमूना के रूप में (आमतौर पर ब्याज की प्रतिलिपि की सबसे कम एकाग्रता है) 0. गणना ΔΔ प्रत्येक नमूना (यहाँ नमूना एक्स के रूप में नामित) के लिए सीटी 31: प्रत्येक नमूना के लिए गुना वृद्धि की गणना: reproducibility पैन अनुसूचित जनजाति के लिए प्रतिलिपि संख्या की भिन्नता (सीवी) के गुणांक की गणनाAT3 और GUSB। जहाँ n = नमूनों की संख्या, = नमूना की गणना की प्रतिलिपि संख्या और = नमूना मतलब है। प्रत्येक नमूना (एकाधिक assays) के उस सीवी चेक ≤10% है। अज्ञात नमूनों के लिए निरपेक्ष qPCR डेटा का विश्लेषण 5. गृह व्यवस्था जीन GUSB के लिए (कदम 4.9 में वर्णित) रिश्तेदार qPCR में प्राप्त सीटी मूल्यों की तुलना करें सुनिश्चित करने के लिए नमूने 'सीडीएनए सांद्रता परिमाण के एक आदेश के भीतर हैं। तदनुसार (सीडीएनए पतला जैसे, अगर नमूना 1 के एक सीटी मूल्य ~ 17.5, और अन्य नमूने 'सीटी मूल्यों है ~ 21 हैं, नमूना 1 मोटे तौर पर 2 (21-17.5) = 11 गुना अधिक ध्यान केंद्रित है एक 1 प्रदर्शन:। के साथ 1 कमजोर पड़ने आवश्यकता से अधिक गिराए बिना ही सीमा के भीतर ultrapure पानी)। नोट: एकदम अलग शुरुआती सांद्रता पूर्वाग्रह रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण (4.1 कदम होगा2)। नमूने के पूर्ण qPCR परख सेट करें। Sα और Sβ प्रति टेबल के रूप में 6 के लिए परख 2A टेम्पलेट थाली तैयार; और प्रति टेबल के रूप में 7 ΔSα और ΔSβ के लिए परख 2 बी तैयार करते हैं। चरणों में वर्णित के रूप में assays के बाहर ले 2.6-2.7.3 (और टेबल 2 बी)। कम से कम एक बार assays दोहराएँ। कदम 2.7.4-2.7.5 में वर्णित के रूप में डेटा की गुणवत्ता और निर्यात की जाँच करें। 25 μl पैन Stat3 प्राइमरों (तालिका -1 सी में प्राइमरों, टेबल 8 में टेम्पलेट) 400 सुक्ष्ममापी पर और सभी चार plasmids के एक मिश्रण या सूचीबद्ध कुल सांद्रता में एक भी प्लाज्मिड का उपयोग कर प्रतिक्रियाओं के साथ पूर्ण qPCR 96 अच्छी तरह से थाली सेट करें। नोट: दक्षता पूर्ण qPCR के लिए कोई फर्क नहीं पड़ता, लेकिन इन प्राइमरों की दक्षता का अनुकूलन रिश्तेदार qPCR (4 चरण) के लिए महत्वपूर्ण है। चिपकने वाला कवर और 12 डिग्री सेल्सियस पर 1,200 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के साथ सील qPCR थाली। पैन के लिए 'नई डिटेक्टर "सेट अप- कदम 2.7.1-2.7.3 में के रूप में Stat3। टेबल -2 सी के अनुसार Stat3 पैन (सापेक्ष qPCR रूप में एक ही स्थिति) के लिए साइकिल सेट करें। कि प्रतिदीप्ति सुनिश्चित पढ़ने (सीटी निर्धारित करने के लिए) प्रत्येक चक्र के 72 डिग्री सेल्सियस कदम के दौरान होता है। दोहराएँ परख कम से कम एक बार reproducibility सुनिश्चित करने के लिए। डेटा की गुणवत्ता और निर्यात की जाँच करें (चरण देखें 2.7.4-2.7.5)। प्रवर्धन भूखंडों घातीय नहीं कर रहे हैं (देखें चित्र 2), नमूना सीडीएनए (1:10) पतला और के रूप में वर्णित (कदम 5.7) परख दोहराएँ। मानक वक्र के समीकरण का प्रयोग (3.2 देखते हैं, चित्रा 3) और नमूनों की सीटी मूल्यों, प्रत्येक ब्याह संस्करण की और प्रत्येक नमूने में पैन Stat3 की प्रतिलिपि संख्या की गणना। प्लॉट लॉग बनाम लॉग (संचयी पूर्ण qPCR प्रतिलिपि संख्या एसटीए के लिए मूल्यों (निरपेक्ष qPCR प्रतिलिपि संख्या पैन Stat3 के लिए प्राप्त मान)T3 ब्याह वेरिएंट)। नोट: ~ 1 आदर्श रेखीय प्रतिगमन और ढलान मूल्यों दोनों होगा। गणना repeatability (3.1 चरण) और reproducibility (चरण 4.13)। 6. विलय निरपेक्ष और सापेक्ष qPCR डेटा कुल Stat3 गुना वृद्धि प्रत्येक ब्याह संस्करण के गुना-वृद्धि की गणना करने के साथ संस्करण के अनुपात में गुणा करें। मानक विचलन की गणना त्रुटि के प्रचार-प्रसार के लिए खाते में निरपेक्ष और सापेक्ष मूल्यों का (चरण 3.1.1 देखें)। निर्धारित बनाने के लिए माप की मानक त्रुटि (SEM) के रूप में दिखाया गया:

Representative Results

अच्छी गुणवत्ता qPCR डेटा एक sigmoidal प्रवर्धन साजिश (चित्रा 2A) उत्पन्न करने, साइकिल चालन के पाठ्यक्रम पर टेप में घातीय वृद्धि वाचक होगा। बहुत ज्यादा टेम्पलेट की उपस्थिति एक उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि में परिणाम कर सकते हैं, जिसका अर्थ है एक अनुचित आधारभूत पहले कुछ चक्रों में स्थापित है। डेटा एक घातीय वक्र (चित्रा 2 बी) प्रदान नहीं करते हैं, तो आगे अनुकूलन के लिए आवश्यक (कदम 3.1 और 3.4 में उल्लिखित) है। समस्या निवारण qPCR परिणाम के बारे में अधिक जानकारी के लिए संदर्भ के लिए 32 देखें। मानक टेम्पलेट अंशशोधक plasmids के लिए उत्पन्न घटता प्रवर्धन (Stat3 Sα के लिए वक्र 3 चित्र में दिखाया गया है) की दक्षता का संकेत होगा। 83 और 95% के बीच क्षमता की स्थिति में वर्णित के तहत मनाया गया। विशिष्टता (3.4 कदम) के लिए समीकरण बराबर क्षमता है, जो है की संभावना नहीं 25, इसलिए विशिष्टता मान लिया गया हैअधिक से अधिक विशिष्टता कारक पता चलता होने की संभावना है। आदेश Stat3 स्तरों के congruency का मूल्यांकन करने के लिए, चार ब्याह वेरिएंट में से प्रत्येक के निरपेक्ष मूल्यों कुल Stat3, बाद का उपयोग कर प्राइमरों एक क्षेत्र amplifying सभी चार ब्याह वेरिएंट के लिए आम (चित्रा 4) के स्तर के साथ ही मापा गया। आदर्श रूप में रेखीय प्रतिगमन (सहसंबंध का संकेत) और ढलान (अभिव्यक्त ब्याह वेरिएंट को पैन Stat3 का अनुपात) दोनों 1 के करीब होना चाहिए। पूर्ण qPCR डेटा पाई चार्ट साइटोकिन्स (चित्रा 5 ए) के साथ के बाद उत्तेजना समय के साथ चार ब्याह वेरिएंट के अनुपात को दिखाने के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। आराम कर eosinophils (0 घंटा), Stat3 Sα की छोटी से छोटी अनुपात था, हालांकि इस प्रकार हमेशा सबसे प्रचुर मात्रा में था। Stat3 β ब्याह वेरिएंट के अंश (बहु एस ^6 + ΔSβ) Stat3 ΔS ब्याह वेरिएंट के अंश से (ΔSα + ΔSβ) लगातार ΔSβ के लिए प्रयोगात्मक दर्ज की मूल्य से कम एक मूल्य दे दी है। अगर splicing घटनाओं स्वतंत्र थे, एक उम्मीद होती है कि गुणा ΔS के अंश β वेरिएंट के अंश से वेरिएंट एक मूल्य है कि प्रयोगात्मक निर्धारित मूल्य के साथ सहमत देना होगा। ΔSβ के उच्च स्तर स्वतंत्र splicing घटनाओं से पता चलता है उम्मीद की तुलना में एक सह splicing पूर्वाग्रह मौजूद है। निरपेक्ष और सापेक्ष qPCR डेटा विलय प्रदर्शन किया है कि सभी Stat3 ब्याह वेरिएंट के स्तर को साइटोकिन्स IL3 और TNFα के साथ वृद्धि हुई के बाद उत्तेजना, स्तर बढ़ता जा 6 घंटा के बाद उत्तेजना के साथ (चित्रा 5 ब – ई)। चार ब्याह वेरिएंट से तीन के लिए, प्रतिलेख के स्तर लगभग 3 गुना IL3 + TNFα इलाज किया eosinophils (6 घंटा) में उच्च मीडिया में eosinophils की तुलना में थेएक ही समय बिंदु पर। Stat3 Sα स्तर इस समय बिंदु पर मीडिया में eosinophils की तुलना में IL3 + TNFα इलाज किया eosinophils में 3.5 गुना अधिक थे। सबसे बड़ी अनिश्चितता (माप का सबसे बड़ा मानक त्रुटि) ΔSβ (चित्रा 5e), जो सभी नमूनों में कुल Stat3 की छोटी अंश शामिल हैं में देखा गया था। इस के रूप में निचले स्तर उच्च सीटी मूल्यों के साथ जुड़े रहे हैं, आश्चर्य की बात नहीं थी। अधिक चक्र की आवश्यकता होती है दहलीज तक पहुंचने के लिए चक्र प्रवर्धन की दक्षता में चक्र करने वाली चक्र भिन्नता के कारण अनिश्चितता परिसर होगा। चित्रा 1:। Stat3 ब्याह वेरिएंट और अखिल Stat3 विशेष Stat3 ब्याह वेरिएंट (Sα, Sβ, ΔSα और ΔSβ क्रमशः) में से प्रत्येक बढ़ाना इस्तेमाल प्राइमर हैं रों की qPCR प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर जोड़े के योजनाबद्धhown। फॉरवर्ड प्राइमरों (Stat3 "एस" और "ΔS") एक्सॉनों 21 और 22 के बीच जंक्शन अवधि में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 2:। QPCR डेटा का प्रवर्धन भूखंडों (क) sigmoidal प्रवर्धन भूखंडों विश्वसनीय प्रवर्धन का मतलब है। इन आंकड़ों Stat3 Sα युक्त प्लाज्मिड के दो धारावाहिक dilutions की qPCR से प्राप्त किया गया, 40 चक्र (एक्स अक्ष) के पाठ्यक्रम पर डुप्लीकेट पतला नमूनों की प्रतिदीप्ति स्तर का प्रतिनिधित्व रंग लाइनों के प्रत्येक जोड़ी के साथ। सबसे केंद्रित नमूना (हरे-ग्रे) पर्याप्त सीमा प्रतिदीप्ति मूल्य (baseli पार करने के लिए (dsDNA बाध्यकारी डाई प्रतिदीप्ति के लिए आनुपातिक, वाई अक्ष पर दिखाया गया है) के साथ चक्र 17 से परिलक्षित किया गया थाहरी तीर के रूप में दिखाया NE)। इसके सीटी मूल्य होगा 17 (ख) गैर-घातीय भूखंडों का सुझाव है कि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति दहलीज सही ढंग से पहले कुछ चक्रों में स्थापित नहीं किया गया। यह एक अवरोध करनेवाला, या अत्यधिक ध्यान केंद्रित किया टेम्पलेट या प्राइमरों की उपस्थिति के कारण हो सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3: प्रवेश के मानक वक्र बनाम सीटी (Stat3 Sα की नकल संख्या) प्रत्येक Stat3 ब्याह संस्करण की नकल संख्या और सीमा चक्र (सीटी) के प्रवेश के बीच एक रैखिक संबंध है।। प्लास्मिड डीएनए से एक मानक वक्र लुभाती बनाना नमूनों की सीडीएनए और इस तरहपतला पीसीआर amplicons से बनाई गई एक वक्र की तुलना में एक बेहतर माप प्रदान करता है। प्रस्तुत डाटा Stat3 Sα युक्त प्लाज्मिड के दो धारावाहिक dilutions की qPCR से प्राप्त सीटी मान रहे हैं। इस वक्र से, प्रत्येक नमूने में नकल संख्या वर्तमान interpolated जा सकता है, और प्रवर्धन दक्षता गणना (83.9%)। हालांकि y- अवरोध ढलान से कम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, अवरोधन पता चलता 42.2 चक्र निश्चित कोई लक्ष्य डीएनए मौजूद है होना करने के लिए आवश्यक होगा। त्रुटि सलाखों से संकेत मिलता है SEM, एन = 3. तुलनात्मक घटता Stat3 Sβ, ΔSα और ΔSβ (नहीं दिखाया गया) के लिए निर्माण किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4: मात्रा निर्धारित पैन की तुलना <strong> Stat3 बनाम संचयी Stat3 ब्याह वेरिएंट। जोड़ा Stat3 ब्याह के प्रतिगमन कुल Stat3 बनाम वेरिएंट ढलान (संचयी करने के लिए पैन का अनुपात) और आर 2 मूल्य (सहसंबंध) 17 नमूने (eosinophils और DLBCL) से 1. मूल्यों के करीब होना चाहिए शामिल थे। त्रुटि सलाखों से संकेत मिलता है एक्स-को-y निर्धारण के SEM, एन प्रत्येक के लिए ≥ 2। संदर्भ 20 से अनुकूलित चित्रा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 5:। Stat3 ब्याह संस्करण का स्तर साइटोकाइन उपचार के दौरान अधिक उतार-चढ़ाव (क) पाई चार्ट प्रत्येक Stat3 ब्याह संस्करण के प्रतिशत का संकेतIL3 और TNFα साथ इलाज के दौरान eosinophils में। (ख – ई) साइटोकिन्स के विभिन्न संयोजनों, सापेक्ष और निरपेक्ष qPCR डेटा के संयोजन से मापा के साथ इलाज किया eosinophils में Stat3 ब्याह वेरिएंट में परिवर्तन Stat3 Sα (ख), Sβ (ग), ΔSα (घ), और ΔSβ (ई) के स्तर। समय के बाद उत्तेजना पर fluctuated। स्तर के शुरू में वृद्धि हुई है, बढ़ता जा 6 घंटा के बाद उत्तेजना। IL3 + TNFα संयोजन अकेले IL3 से सभी चार Stat3 ब्याह वेरिएंट की उच्च अभिव्यक्ति हासिल। SEM त्रुटि के प्रचार-प्रसार के लिए लेखांकन प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए गणना की थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। तालिका एक: प्रवर्धन (क), निरपेक्ष (ख) और रिश्तेदार (ग) मात्रात्मक पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों। क्लोनिंग प्राइमरों प्रतिबंध दृश्यों और कुशल काटने के लिए 5'-एक्सटेंशन है। KpnI और NheI प्रतिबंध साइटों बोल्ड में संकेत कर रहे हैं। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। तालिका 2 पीसीआर साइकिल चालन के मापदंडों (बाएं) और अभिकर्मक की मात्रा (दाएं) प्रवर्धन के लिए (एक), रिश्तेदार (ख), निरपेक्ष (ग) मात्रात्मक पीसीआर। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 3 / 54473tbl3.jpg "/> तालिका 3:। निरपेक्ष qPCR प्लाज्मिड अंशांकन परख के लिए खाका इस परख reproducibility और दक्षता, साथ ही मानक घटता जिसमें से डेटा बैठाना पैदा करने का आकलन करने के लिए आवश्यक है। "गैर लक्ष्य" घोला जा सकता है विशिष्टता के एक अनुमान दे देंगे। अनुकूलन स्थिरता प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। सारणी 4:। रिश्तेदार qPCR (पैन Stat3 और गृह व्यवस्था जीन GUSB) अंशांकन परख के लिए खाका पूर्ण qPCR के विपरीत, इस परख के बिंदु की स्थिति है, जिस पर प्रवर्धन दक्षता है ~ 100% निर्धारित करने के लिए है।tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। तालिका 5:।। पैन Stat3 और गृह व्यवस्था जीन GUSB को मापने के लिए रिश्तेदार qPCR नमूना परख के लिए खाका मानक घटता नमूनों के साथ एक साथ दोहराया जाता है assays के तुलनीय दक्षता सुनिश्चित करने के लिए इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। तालिका 6: एस वेरिएंट को मापने के लिए पूर्ण qPCR नमूना परख के लिए खाका मानक घटता नमूनों के साथ एक साथ दोहराया जाता है तुलनीय eff सुनिश्चित करने के लिए। assays के iciency। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। टेबल 7:।। ΔS वेरिएंट को मापने के लिए पूर्ण qPCR नमूना परख के लिए खाका मानक घटता नमूनों के साथ एक साथ दोहराया जाता है assays के तुलनीय दक्षता सुनिश्चित करने के लिए इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। टेबल 8: अखिल Stat3 को मापने के लिए पूर्ण qPCR नमूना परख के लिए खाका।large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हम आदेश का स्तर और eosinophils और लिंफोमा कोशिकाओं में Stat3 ब्याह संस्करण टेप के अनुपात का आकलन और जानने के साइटोकाइन उत्तेजना का स्तर और अनुपात प्रभावित है कि क्या करने के लिए इस प्रोटोकॉल विकसित की है। (संदर्भ 33 में समीक्षा) Stat3, इसके pleiotropic और अनिश्चित कार्यक्षमता की वजह से विशेष रुचि का है कि क्या यह एक oncoprotein या कैंसर में ट्यूमर शमन के रूप में कार्य पर परस्पर विरोधी रिपोर्टों के साथ। Stat3 α और β ब्याह संस्करण समारोह में मतभेद पहले से 34,35 विशेषता किया गया था, और हमारे प्रोटोकॉल एक तोड़े नीचे / फिर से अभिव्यक्ति विश्लेषण है कि एस के एक इष्टतम अनुपात के लिए एक की जरूरत का सुझाव मदद की और ΔS टेप 19।

अलग ब्याह वेरिएंट की सही मात्रा का ठहराव विषम Stat3 समारोह से संबंधित संस्करण रचना ब्याह करने की आगे की जांच की सुविधा होगी। प्रोटोकॉल निरपेक्ष और सापेक्ष qPCR डेटा को एकीकृत, अटल बिहारी की क्षमता के संयोजनघुला हुआ पदार्थ qPCR ब्याह संस्करण अनुपात की गणना करने के लिए, और रिश्तेदार qPCR समग्र Stat3 अभिव्यक्ति में परिवर्तन को मापने के लिए। यह दृष्टिकोण एक दो वैकल्पिक ब्याह साइटों को और अधिक से अधिक 50 न्यूक्लियोटाइड अलावा में अनुक्रम में सूक्ष्म अंतर splicing अनुपात में भेद और एक साथ मापने के लिए अनुमति देता है। Splicing घटनाओं के अनुपात का निर्धारण व्यक्तिगत रूप से उल्लेखनीय लग रहा है कि एक सह splicing पूर्वाग्रह ऐसी ही अस्तित्व में ΔSβ स्तरों यदि दो साइटों का उपयोग करता है बेतरतीब ढंग से 25 spliced रहे हैं प्रत्याशित की तुलना में अधिक हैं कि झुकेंगे नहीं होता।

गंभीर, प्लाज्मिड अंशांकन घटता के उपयोग के साथ पूर्ण qPCR ब्याह बदलाव है कि अत्यधिक इसी तरह के दृश्यों में परिणाम की (उप इष्टतम क्षमता पर) मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है। हम आशा करते एक उपन्यास सूक्ष्म splicing qPCR परख मोटे तौर पर दो महीने का समय लग अनुकूलन करने के लिए करना चाहिए। परख विकास में महत्वपूर्ण कदम निरपेक्ष qPCR के लिए मानक घटता पैदा करने में इस्तेमाल किया Stat3 plasmids की रचना कर रहे हैं; तजरबा सेइष्टतम प्राइमर दृश्यों और साइकिल चालन के मापदंडों का निर्धारण विशिष्टता और reproducibility सुनिश्चित करने के लिए; और रिश्तेदार qPCR डेटा के एकीकरण बढ़ाता GAPDH अभिव्यक्ति के लिए अखिल Stat3 अभिव्यक्ति रिश्तेदार से निकाली गई। नकल संख्या के संबंध संचयी मात्रा का ठहराव बनाम Stat3 पैन द्वारा मात्रा (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) से पता चलता है कि प्रोटोकॉल विश्वसनीय परिणाम पैदा करता है।

तकनीक का एक चेतावनी व्यापक मान्यता प्रक्रिया है। यह इंट्रा-परख परिवर्तनशीलता (repeatability), interassay परिवर्तनशीलता (reproducibility) और विशिष्टता का आकलन करने के लिए आवश्यक है। प्रोटोकॉल इन मापदंडों के लिए सांख्यिक outputs पाने के लिए तरीके की रूपरेखा। हम दक्षता समझा ≥75%, विशिष्टता कारक ≥4, भिन्नता (reproducibility) के गुणांक ≤10% और सीटी मानक विचलन (repeatability) ≤0.2 के रूप में उपयुक्त थ्रेसहोल्ड 30। म्यूटेशन या Stat3 अनुक्रम अमीनो एसिड 1-690 में विलोपन discove नहीं होगा, इस प्रोटोकॉल द्वारा लाल हालांकि वे splicing अनुपातों को प्रभावित कर सकता है। ट्रांसक्रिप्ट अनुपात अनुपात 36 proteoform के लिए आनुपातिक नहीं हो सकता है।

चूंकि नमूनों की कुल सीडीएनए की मात्रा शुरू भिन्न है, निरपेक्ष qPCR एक नमूना भीतर ब्याह वेरिएंट की प्रतिलिपि संख्या की तुलना लेकिन अंतर-नमूना तुलना के लिए नहीं है जब तक कि एक स्थापित गृह व्यवस्था जीन का उपयोग कर रिश्तेदार qPCR के साथ युग्मित के लिए उपयुक्त है। विधि reproducibility 30 के लिए MiQE qPCR दिशा निर्देशों के अनुरूप करार दिया। पीसीआर साइकिल चालन के मापदंडों और प्राइमर सांद्रता प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए अगर अन्य उपकरणों का इस्तेमाल किया जाता है संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है। बिल्कुल सही विशिष्टता काफी समझौता किए दक्षता के बिना संभव नहीं है, लेकिन लक्ष्य परिमाण के आदेश के एक से अधिक चार से अधिक कुशलता से परिलक्षित किया गया था।

रैखिक डीएनए परिपत्र की तुलना में अधिक आसानी से परिलक्षित होता है। एक वैकल्पिक प्लाज्मिड संतोषजनक मानक घटता प्रदान नहीं करता है (2 आर <; 0.95), मात्रा का ठहराव के लिए पहले ही साइट प्रतिबंध से प्लाज्मिड linearizing पर विचार करें। अनुकूलन qPCR अच्छी गुणवत्ता डेटा (चित्रा 1) प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। अधिकांश qPCR प्रोटोकॉल दो कदम साइकिल पर भरोसा करते हैं, और मशीनों के हिसाब से अनुकूलित कर रहे हैं। हीटिंग ब्लॉक की गैर वर्दी हीटिंग तीन कदम साइकिल चालन में exacerbated किया जा सकता है, गरीब repeatability में योगदान दे। Assays आदर्श एक समर्पित लामिना का प्रवाह हुड में, फिल्टर पिपेट सुझावों और ultrapure पानी के साथ बाँझ शर्तों के तहत स्थापित किया जाना चाहिए। क्योंकि दूषित पदार्थों को असंगत परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, assays अप फिल्टर पिपेट सुझावों और ultrapure पानी के साथ बाँझ शर्तों के तहत, आदर्श एक समर्पित लामिना का प्रवाह हुड में स्थापित किया जाना चाहिए। QPCR अनुकूलन के बारे में अधिक जानकारी के लिए Bustin एट अल को देखें। 32

बढ़ाता Stat3 संदर्भों की एक संख्या में अधिक से अधिक जानकारी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। अपने स्वयं के अभिव्यक्ति 37 Stat3 ऑटो को नियंत्रित करता है, और प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित मदद मिल सकती हैस्पष्ट करने के लिए है कि क्या Stat3 ब्याह वेरिएंट के अनुपात में इस सकारात्मक प्रतिक्रिया पाश को विनियमित करने के लिए योगदान करते हैं। प्रोटोकॉल के रूप में अलग-अलग घनत्व 38 पर या विकास के पाठ्यक्रम पर कोशिकाओं में मनाया ब्याह संस्करण अनुपातों में बदलाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: यह ज्ञात है कि hematopoiesis 16 के दौरान प्रोटीन के स्तर पर Stat3 α / β अनुपात बदल जाता है। Sundin एट अल। पाया गया कि एक intronic एकल nucleotide बहुरूपता पक्षपाती एक्सॉन 12 के Stat3 में नौकरी सिंड्रोम 39 के साथ एक रोगी के splicing। ऐसा नहीं है कि एक्सॉन 21 और 22, या एक्सॉन 22 और 23 के बीच इंट्रोन्स में मौजूद कई SNPs में से एक क्रमशः ΔS / एस के splicing अनुपात और α / β में योगदान कर सकते बोधगम्य है। परख कैंसर कोशिकाओं, जहां म्यूटेशन या splicing नियमन में परिवर्तन splicing प्रक्रिया से 40 पूर्वाग्रह पेश हो सकता है में Stat3 टेप यों इस्तेमाल किया जा सकता है। Splicing कारकों में म्यूटेशन (SF3B1 की तरह), observ के रूप मेंMyelodysplastic सिंड्रोम 41 में प्रवर्तन निदेशालय भी परिवर्तन है कि इस प्रोटोकॉल के द्वारा मापा जा सकता है हो सकता है।

अधिक मोटे तौर पर, इस दृष्टिकोण विशेष रूप से पता लगाता है splicing में सह एसोसिएशन, जो पारंपरिक शाही सेना Seq, और न ही मानक qPCR के साथ संभव नहीं है। परस्पर अनन्य एक्सॉन splicing की घटना splicing फैसले के समन्वय को दर्शाता है, वहीं अन्य splicing घटनाओं के सह एसोसिएशन अच्छी तरह से शोध नहीं किया गया है। एक हाल ही में वर्णित वैकल्पिक पद्धति है, जिसमें शाही सेना Seq इतनी के रूप में पूर्ण लंबाई सीडीएनए पूछताछ करने के लिए संशोधित किया गया था, पता चलता है दूर splicing घटनाओं अधिक सह निर्भर तुलना में पहले सोचा 42 हैं।

Stat3 एक दाता मिलकर ब्याह साइट में शामिल है। अपनाने मिलकर ब्याह साइटों अधिक लगातार 43 कर रहे हैं और उल्लिखित प्रोटोकॉल के सिद्धांतों NAGNAG splicing और 200 न्यूक्लियोटाइड के भीतर अन्य splicing घटनाओं के संयोग का पता लगाने के लिए assays के विकास के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा कर सकता है। अन्य पोतेनTiAl अनुप्रयोगों अन्य सूक्ष्म अनुक्रम मतभेद, indels या दो / तीन nucleotide बहुरूपताओं 44 तरह के संयोग की मात्रा का ठहराव शामिल हैं।

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

P01HL088584: लेखक airway सूजन और remodeling में eosinophils की भूमिका पर कार्यक्रम परियोजना अनुदान के लिए स्वास्थ्य-NHLBI के राष्ट्रीय संस्थानों को स्वीकार करना होगा (पीआई: एन Jarjour), और विस्कॉन्सिन Carbone कैंसर केंद्र और चिकित्सा विभाग के विश्वविद्यालय अंदर का वित्त पोषण के लिए। हम चार Stat3 वेरिएंट क्लोनिंग के लिए डगलस Annis धन्यवाद।

Materials

MJ Research PTC-200 Thermal Cycler GMI N/A Used for standard PCR
7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems N/A qPCR machine
GS-6R Beckman Coulter N/A centrifuge for 96-well plates
Nanodrop 2000 sprectrophotometer ThermoFisher Scientific N/A
RPMI-1640 medium Sigma Aldrich R8758 cell culture medium
PfuTurbo DNA Polymerase Agilent Technologies 600410 DNA polymerase for standard PCR
KpnI New England Biosciences R0142S
NheI New England Biosciences R0131S
SYBR Green PCR Master Mix Qiagen 330523 qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix
Rneasy Mini Kit Qiagen 74204 RNA extraction kit
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen (ThermoFisher Scientific) 18080-044 cDNA synthesis kit
Primers Integrated DNA Technology N/A
NEBuffer 1.1 New England Biosciences B7201S
GenePure LE Agarose ISC BioExpress E-3120-500 component of TAE gel
Pipettors Major lab suppliers (MLS) N/A
Filter pipette tips Neptune Scientific BT10XL, BT20, BT200
EU One Piece Thin Wall Plate MidSci ABI7501
ThermalSeal A Sealing Film MidSci TSA-100 96 well plate seal
pET-Elmer (variant of pET-28a) Novagen; modified in Mosher lab N/A Details in PMID: 20947497
Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system Promega A1460 Plasmid purification
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ThermoFisher Scientific 4337455 Sequencing kit
QIAEX II Gel Extraction kit Qiagen 20021 Amplicon purification
DH5α competent cells ThermoFisher Scientific 18265-017 available from several providers, see PMID: 2162051
kanamycin Research Products International Corp. K22000-5.0
Tris base ThermoFisher Scientific BP152-5 component of TAE buffer
Acetic acid, glacial ThermoFisher Scientific A38C-212 component of TAE buffer
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) E-5134 component of TAE buffer
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705 component of Luria Broth
Bacto Yeast extract, technical BD Biosciences 288620 component of Luria Broth
Sodium chloride ThermoFisher Scientific S271-10 component of Luria Broth
Sodium hydroxide ThermoFisher Scientific SS255-1 component of Luria Broth
Bacto Agar BD Biosciences 214010 component of Luria Broth plate
Lasergene SeqBuilder DNASTAR Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR)
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Turton, K. B., Esnault, S., Delain, L. P., Mosher, D. F. Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts. J. Vis. Exp. (116), e54473, doi:10.3791/54473 (2016).
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