Summary
Мы сообщаем о изысканную процедуру хлорида железа (FeCl 3) индуцированный моделей тромбоз на сонной и брыжеечной артерии, а также вены, характеризующийся эффективно использовать прижизненной микроскопии для контроля времени окклюзионные тромбообразования.
Introduction
Артериальный тромбоз (сгусток крови) является частым осложнением многих системных заболеваний, связанных с хроническим воспалением, включая атеросклероз, сахарный диабет, ожирение, рак и хронические аутоиммунные ревматологических заболеваний. Тромбы, которые происходят в стволе артериальной циркуляции с несоответствующей активацией тромбоцитов, агрегации и последующих coagulatory механизмов, а также участвуют в сердечных приступов, инсультов и потери конечностей. Стенка сосуд представляет собой сложную систему , которая включает в себя различные типы клеток и зависит от множества внешних факторов , в том числе напряжения сдвига, циркулирующих в крови клеток, гормоны и цитокины, а также экспрессию антиоксидантных белков в стенке сосуда. В пробирке эксперименты не может реплицировать это сложная среда , и поэтому в естественных условиях исследования с использованием животных моделей имеют решающее значение для обеспечения лучшего понимания механизмов , участвующих в тромботических заболеваний.
Мыши было показано, что симИЛАР механизмы для человека с точки зрения тромбоз, атеросклероз, воспаление и диабета 1,2. Кроме того, трансгенные и нокаутные мыши могут быть созданы для тестирования функции специфических генных продуктов в сложном физиологическом или патологическом среде. Такие исследования имитировать патологии человека и может предоставить важную механистическую информацию, связанную с открытием новых путей и методов лечения, а также обеспечивают важные детали при характеристике эффекты препарата на тромбоз.
Патологические артериальных тромбов происходят из - за эндотелиального повреждения слоя или дисфункции и воздействия на поток крови к субэндотелиальном матрицы 3,4. Различные модели тромбоз, были разработаны , чтобы вызвать это повреждение эндотелия , таких как механическое повреждение, фотореакционноспособная соединение бенгальский розовый на основе окислительного повреждения и лазерной травмы 5. В этом спектре, хлорид железа (FeCl 3) индуцированный сосудистых повреждений является широко используемой моделью тромбоза. Этот реагент, когдаприкладывается к внешней аспекту сосудов вызывает окислительное повреждение клеток сосудов 6-8, с потерей защиты эндотелиальных клеток от циркулирующих тромбоцитов и компонентов каскада свертывания. Модель FeCl 3 проста и чувствительна к обоим антикоагулянта и анти-Тромбоциты препаратов, и было выполнено на сонных и бедренных артерий, яремной вены, и брыжеечных и cremasteric артериолы и венулы у мышей, крыс, морских свинок и кроликов 6-15.
Один измеряемый параметр в этой модели является то, время , прошедшее после травмы до полной окклюзии сосуда, измеряемое как прекращение кровотока с помощью измерителя потока Доплера или под непосредственным наблюдением с прижизненной микроскопии 6,7,9. Диапазон времени от 5 до 30 мин, как сообщается в различных исследованиях в C57BL6 мышей 7-10,16, предполагая , что концентрации FeCl 3, виды анестезии, хирургических методов, мыши возраста, геномную фона, метод измерения BLOOD потока, а также других параметров окружающей среды оказывают значительное влияние в этой модели. Эта широкая изменчивость затрудняет сравнивать исследования из различных исследовательских групп и может сделать обнаружение тонких различий трудно.
С видением , чтобы свести к минимуму такие изменчивости и установить равномерно воспроизводимые в модели естественных условиях системы, мы усовершенствовали модель артерии индуцированная сонной FeCl 3 , что делает данные с высокой воспроизводимостью с минимальным изменением 6-10,16-19. В этой статье мы описываем и делиться навыками и сообщают о нескольких репрезентативных экспериментальных примеров, которые могут извлечь выгоду из этой модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры и манипуляции животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитетов (IACUC) из клиники Кливленда в соответствии с политикой Соединенных Штатов службы общественного здравоохранения на гуманное лечение и использовании животного мира , а также в Руководстве NIH по уходу и Использование лабораторных животных.
1. Подготовка:
- Флуоресцентным красителем для нанесения этикеток Тромбоциты
- Готовят раствор родамина 6G, 0,5 мг / мл, в физиологическом растворе и стерилизацию раствора с фильтром 0,22 мкм.
- FeCl 3 Решение
- Сделать свежий раствор с концентрацией 30% FeCl 3 (негашеной, равна 1,85 м) в чистой воде, и фильтр с фильтром 0,45 мкм. Подготовка 5 мл свежего FeCl 3 раствора при требуемой концентрации [например, 2,5% (0,154 М), 5% (0,308 м), 7,5% (0,463 М), 10% (0,617 М) и 12,5% (0,771 М)] с разбавлением 30% раствора FeCl 3 с водой , которую яна 6 см блюдо культуры ткани и держать крышку закрытой.
Примечание: Использование культуры блюдо делает его легче подобрать фильтровальную бумагу , насыщенную раствором FeCl 3 , чем забрать его из узкого контейнера, например, 1,5 мл трубки микроцентрифужных. FeCl3 крайне опасно и что меры предосторожности, такие как использование перчаток и пальто лаборатории и т.д., средства индивидуальной защиты, всегда должны быть приняты.
- Сделать свежий раствор с концентрацией 30% FeCl 3 (негашеной, равна 1,85 м) в чистой воде, и фильтр с фильтром 0,45 мкм. Подготовка 5 мл свежего FeCl 3 раствора при требуемой концентрации [например, 2,5% (0,154 М), 5% (0,308 м), 7,5% (0,463 М), 10% (0,617 М) и 12,5% (0,771 М)] с разбавлением 30% раствора FeCl 3 с водой , которую яна 6 см блюдо культуры ткани и держать крышку закрытой.
- фильтровальная бумага
- Вырезать фильтровальную бумагу до 1 мм х мм размером 2. Замачивание достаточное количество кусков разрезанного фильтровальную бумагу в растворе FeCl 3 в том же блюде.
- Папаверин гидрохлорид Раствор
- Готовят папаверина гидрохлорида раствор (25 мг / мл) в воде и стерилизуют раствор с 0,22 мкм фильтр.
- агарозном геле
- Приготовьте 2% -ном агарозном геле в PBS или физиологический раствор в 6-луночный планшет для тканевых культур, ~ 1 см толщиной, и сут его полукруга с диаметром ~ 3 см.
2. FeCl 3 Индуцированные сонных артерий Тромбоз Травма Модель
- Хирургические процедуры для тромбозов модели
- Используйте 8 - 12 недель C57BL6 мышей (или другие штаммы в случае необходимости). Обезболить мышей со смесью кетамина (100 мг / кг) / ксилазином (10 мг / кг) через внутрибрюшинного введения. Подтвердите глубину анестезии пальца щипать.
Примечание: Это количество кетамина / ксилазина достаточно , чтобы держать животное в стабильной анестезии и никакой боли (ответ на пальце ноги щипать) , по крайней мере , 1 ч. - Удалите шерсть на шее и верхней части грудной клетки с небольшим животным электрической машинки для стрижки. Крем для депиляции не является необходимым. Нанесите нейтральную мазь нефтяное глаз на глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Закрепите мышь в положении лежа на спине на крышке 15 см планшета для культуры ткани. Используйте одну длинную ленту (~ 10 см), чтобы обеспечить гинуг конечностей и нижней части тела, а также два куска тонкой ленты (2 см х 0,5 см), чтобы обеспечить передние ноги. Используйте 4-0 швом , чтобы обернуть вокруг резцами, лента два конца шовного материала к крышке , чтобы держать мыши шею прямой (рисунок 2).
- Поместите пластину с головой мыши по направлению к оператору при хирургическом источника света.
- Стерилизовать хирургический сайт с алкоголем площадку. Используйте микро-Адсон пинцет, чтобы держать кожу и использовать хирургическое ножницы, чтобы сделать небольшой разрез (2 - 3 мм).
- Держите кожу разреза с щипцами и вставить хирургические ножницы с зев закрыт в разрез. Нажмите ножницы подкожно в направлении подбородка или рукоятки, а затем откройте ножницы, чтобы освободить кожу от подкожного слоя.
- Порезать кожу с хирургическими ножницами , чтобы сделать срединный разрез от рукоятки до уровня подъязычной кости (рис 3А и 3В). Попросту рассекают тонкую фасцию (пунктирная линия, в
ПРИМЕЧАНИЕ: Рукоятка (черная стрелка на рисунке 3C) и трахеи (Т на рис 3C) будет видно после этого шага. - Удерживайте мягкую ткань и кожу увидеть в правой части рукоятки с пинцетом Грефе, вставьте кровоостанавливающего под фасции по направлению к положению 2 часа (желтая пунктирная линия на рисунке 3C), откройте пасть кровоостанавливающего , чтобы освободить яремной вены от окружающих тканей.
- Вырезать фасции, мягкие ткани и кожу в направлении положения 2 часа (рис 3C) с хирургическими ножницами , чтобы обнажить правую яремную вену (рис 3D, стрелка).
- Draw около 200 - 300 мкл родамина 6G раствора с помощью 1 мл шприц с иглой 22 G, а затем изменитеэто 30 G иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это защищает 30 G иглу от повреждения его тонкого наконечника. Непосредственно рисунок раствора родамина 6G с иглой 30 G не повредит наконечник; Однако касаясь стенки контейнера случайно может привести к повреждению, что может сделать инъекции трудно. - Промойте 30 G иглы, медленно выдавливая родамина 6G решение, убедитесь, что пузырьки воздуха не остаются в шприц или иглу. Держите 100 мкл родамина 6G раствора для инъекций.
- Изгиб 2 - 3 мм кончик иглы под углом 90 ° с держателем иглы, которая предотвратит введение иглы слишком глубоко в яремную вену и делает инъекцию более легко контролировать (рис 3D).
- Вводят раствор родамина 6G в правую яремную вену на этикетке тромбоцитов. Для того, чтобы стабилизировать шприц и держать иглу в положении, удерживая шприц с одной стороны, и иглы с пинцетом Грефе с другой стороны, во время injection.Afинъекции тер, зажать место инъекции с пинцетом Грефе, чтобы избежать кровотечения.
- Откройте пасть кровоостанавливающего и вставить его под пинцетом Грефе, чтобы зажать стенку сосуда в месте инъекции, а затем перевязать место инъекции с 6-0 швом.
Примечание: В качестве альтернативы стадии 2.1.15, оказывая давление на месте инъекции с пальцем в течение 2 мин будет остановить кровотечение; Тем не менее, этот метод имеет риск возникновения необходимости дальнейшего кровотечения, если тромб в месте инъекции удаляется случайно. - Попросту рассекают мягкие ткани и фасции вокруг левой подчелюстной железы с кровоостанавливающего и пинцетом Грефе и тянуть железу к положению 7 часов (рис 3Е) , чтобы разоблачить левой кивательной мышцы (синяя стрелка на рисунке 3Е).
- Попросту рассекают фасцию (рис 3E, пунктирная линия) между левым кивательной мышцы и лопаточно-подъязычная мышца или sternohyподъязычная мышца (рис 3E, зеленая стрелка) , расположенный на левом участке трахеи с кровоостанавливающего.
- Пропустите иглу с 6-0 шелковой нити (длиной около 15 см) в середине кивательной мышцы (синяя стрелка на рисунке 3Е), поместите два конца нити вместе и вытяните нить в боковом направлении положения 10 часов ,
Примечание: Эта процедура должна быть выполнена тщательно , чтобы избежать травм левой яремной вены, которая находится за пределами кивательной мышцы. - Попросту отделить тонкую грудино-подъязычная мышца и / или лопаточно-подъязычная мышца разоблачить сонной артерии (CA) (рисунок 3F стрелка) после того, как отстраняясь кивательной мышцы. Вырезать грудино-подъязычная мышца и / или лопаточно-подъязычная мышца, как это необходимо. Используйте кровоостанавливающего, чтобы отделить мягкие ткани от CA, не касаясь CA.
Примечание: CA сопровождается блуждающего нерва, белая структура рассматривается в - Используйте пинцет тоненького кончика, чтобы поднять боковую облицовку вокруг СА, избегая блуждающего нерва и CA. Используйте другой прекрасный кончик пинцетом, чтобы пробить отверстие на лицевой панели между СА и блуждающего нерва.
- Пропустите крюк через отверстие и осторожно поднимите ЦС, а затем поместить кончик пинцетом мелкие под CA. Переместить крюк и щипцов в противоположных направлениях вдоль СА раздеться адвентициальных мягких тканей. Свободный , по меньшей мере ~ 5 мм длина CA (рис 3H, синяя стрелка) из окружающих тканей.
- Для блокирования фоновой флуоресценции, нажмите конец черной пластиковой кофе мешалкой с плоским, квершлаг мешалку кофе в 3 мм кусок, а затем разрезают в продольном направлении вдоль сгиба краев , чтобы получить две части "U" формы из пластика (рис 3Н, зеленый стрелка).
- Используйте 8 - 12 недель C57BL6 мышей (или другие штаммы в случае необходимости). Обезболить мышей со смесью кетамина (100 мг / кг) / ксилазином (10 мг / кг) через внутрибрюшинного введения. Подтвердите глубину анестезии пальца щипать.
- Передача мыши и пластины крышку вместе с предметный столик микроскопа и место в соответствующем положении под водой объектива 10X. Заполнить пространство между 10-кратным объективом и СА с физиологическим раствором.
- Запустите приложение цифровой записи видео программное обеспечение, а также запускать новый файл и назовите его соответствующим образом. Запись изображений обычного сосуда и запишите номер кадра, когда запись видео останавливается.
Примечание: Ссылка на программное обеспечение для записи видео в компьютер для записи. Мы используем программное обеспечение цифровой записи видео и последующие описания основаны на данной заявке.
Примечание: Так как механической TRAУма может повредить эндотелий и привести к образованию тромба 20, необходимо подтвердить , что нет никакого хирургического повреждение стенки сосуда до начала травмы FeCl 3. Кроме того , необходимо , чтобы подтвердить , что не осталось ткани вокруг СА, которая может образовывать барьер и ослабить эффект FeCl 3 индуцированного повреждения. Запишите номер кадра записей позволит легко анализировать видео в соответствии истекшее время позже. - Перемещение мыши с пластинчатой крышкой из объектива 10X. Сложите угол бумажное полотенце, чтобы сделать тонкий и тонкой кончик и использовать его тщательно промокните физиологический раствор вокруг СА (не касаясь CA), а также в других местах, в операционное поле. Это важно , чтобы избежать разбавления раствора FeCl 3 используется.
- Используйте мелкозернистый кончик пинцетом и возьмите кусочек фильтровальной бумаги , насыщенный раствором FeCl 3 и поместите его непосредственно на ЦС и держать его на месте в течение 1 мин.
Примечание: TO визуализация помощью кровотоке и уборочного точных данных, поместите фильтровальную бумагу близко к дистальному концу обнаженного СА (рис 3I) и оставить короткий сегмент на проксимальном участке (зеленая стрелка на рисунке 3I) для наблюдения кровотока в последнее время фаза (см ниже). - Удалите фильтровальную бумагу (на этот раз точка определяется как начало "после травмы") и полоскание СА с физиологическим раствором (по крайней мере, 2 мл).
- Поместите мышь с пластинчатой крышкой обратно в объектив 10Х; наблюдать за судно и начать записывать видео изображений. Запишите номер видеокадра в конце первой минуты записи.
Примечание: Образование тромбов определяется накоплением флуоресцентных тромбоцитов, который наблюдается в режиме реального времени видеоизображения на экране компьютера или под микроскопом. Запись видео изображения сразу после ввода мышь обратно под микроскопом. Продолжайте запись до конца первой минуты после удаления диафрагменноеМСДЭНИ бумага. Обратите внимание на весь сосуд от дистальной к проксимальной сайтов для получения информации о травме, а затем сосредоточиться на интересующей области (как правило, является центром травмированной области) для дальнейшей обработки изображений. - Видеоизображений Запись в течение 10 сек каждую минуту в течение первых 10 мин (например, 2:55 до 3:05) , а затем 10 секунд каждую минуту до конца эксперимента. Запишите номера кадров, когда каждая запись была остановлена.
Примечание: Конечные точки модели являются: 1) , когда поток крови прекратился> 30 сек; или 2), если закупорка не наблюдается через 30 мин после травмы. В этом случае рекомендуется использовать 30 мин для статистического анализа. Установите время экспозиции в записи видео, как 10 мс в начале, так что это будет легко наблюдать поток крови через тромбов. Когда тромбы становятся большими и флуоресценцию насыщает датчика камеры, становится трудно определить кровоток через тромбов. Чтобы решить эту проблему, переместите се изображенияNTER к проксимальной неповрежденную месте (Рисунок 3I, зеленая стрелка) , где поток крови может все еще быть отчетливо наблюдается. Мы также увеличить Expose Время до 15 или 20 мс при фокусировке на проксимальном ун-мозговой травмой месте, поэтому поток крови может наблюдаться более четко. Когда поток крови прекратится, многочисленные крупные клетки (лейкоциты) начинают катиться на стенке сосуда у проксимального участка тромба. Расход обычно останавливается в течение 2 - 3 мин после появления крупных клеток. Запишите Expose Время на листе записи, если она изменяется. Обычно это занимает около 30 минут после анестезии до конца эксперимента, если использовались нормальные мышей дикого типа C57BL6.
ВНИМАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте белую агрегированный сгустка тромбоцитов как признак прекращения кровотока, который не даст точные данные , и это зависит от времени экспозиции. Белый тромб покрыты просвет сосуда не означает, что поток крови прекратилась (см представитель видео 1).
3. FeCl 3 Индуцированные брыжеечная артерия / Тромбоз Модель Vein
- Обезболить 8 - 12 недель старых мышей C57BL6, как указано в разделе 2.1.1. Нанесите мазь ветеринара на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Вводят папаверина раствора (всего 0,4 мг / мышь) внутрибрюшинно для ингибирования кишки перистальтику.
- Удалите шерсть на шее и животе с животным электрической машинки для стрижки. Крем для депиляции не является необходимым.
- Закрепите мышь в положении лежа на спине на крышке 15 см планшета для культуры ткани. Используйте четыре куска ленты небольшой (2 см х 0,5 см), чтобы обеспечить все ноги. Используйте 4 -0 швом , чтобы обернуть вокруг резцами, лента два конца шовного материала к крышке , чтобы держать шею прямой (рисунок 2).
- Выполните процедуры 2.1.4 -2.1.15 подвергать яремную вену для инъекции родамина 6G на этикетке тромбоцитов.
- Выполните срединный разрез через кожу от мечевидного к нижней части живота с помощью хирургических ножниц (рис 4а). Возьмите среднюю брюшины (также называемый Linea альба, рис 4A, стрелка) с Грефе пинцет, который ясно и не имеет кровеносных сосудов, поднять около 2 - высокий 3 мм, не подтверждают нет кишечника под линии разреза, и разрезают брюшину открыт в продольном направлении до тонких ножниц (рис 4б).
- Повторно закрепить мышей правой боковой позиции. Поместите агарозный гель полукруг близко к животу, и осторожно экстериоризоваться кишок и распространить его на верхней части геля с пинцетом Грефе (рис 4в). Используйте второй ветви для тромбоз эксперимента (рис 4C, стрелка).
Примечание: Используйте кровоостанавливающего или Micro-Адсон пинцет , чтобы помочь экстериоризоваться кишечника. Избегайте больнокишечника и сосуд. - Поместите 5 - 6 капель физиологического раствора, чтобы сохранить влагу кишечника и судна. Перенесите мышь с крышкой пластины вместе, чтобы столик микроскопа и место в соответствующем положении под 10X сухой объектив.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сухую линзу , поскольку jejunoileal мембрана не может содержать физиологический раствор. Убедитесь в том, чтобы упасть солевой раствор на обрабатываемые ткани, чтобы держать их во влажном состоянии. - Пятно физиологический раствор вокруг брыжеечной артерии и вены перед обработкой.
- Используйте пинцет тоненького кончика , чтобы забрать кусок фильтровальной бумаги , насыщенный 12,5% раствором FeCl 3 и поместите его непосредственно на брыжеечной артерии и вены в течение 1 мин (рис 4D). Удалите фильтровальную бумагу (на этот раз точка определяется как начало "после травмы") и полоскать травмированного брыжеечной артерии и вены с физиологическим раствором (по крайней мере, 2 мл).
- Поместите мышь с пластинчатой крышкой задней под сухой объектив 10Х; соблюдать сосуды и начинают RecORD видео изображения, упомянутые в пункте 2.2).
Примечание: Конечные точки этого эксперимента являются: 1) , когда поток крови прекратился> 30 сек; или 2), если закупорка не наблюдается через 30 мин после травмы, и в этом случае используют 30 мин для статистического анализа. - В конце эксперимента, усыпить мышей с использованием передозировок кетамин / ксилазин (200/20 мг / кг) с последующим смещением шейных позвонков после того, как не дыхание и сердцебиение не подтверждены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сонная артерия Тромбоз Модель
У мышей с C57BL6 фоне, мы рекомендуем использовать 7,5% FeCl 3 для лечения сосуда в течение 1 мин в качестве отправной точки. Под обработкой 7,5% FeCl 3, границы поврежденной области и нормальной стенки сосуда легко идентифицируются под микроскопом (см онлайн видео 1), предполагая , что эндотелиальные слой был значительно поврежден. Тромбы образуются сразу же после обработки FeCl 3, и наблюдаются во всех WT C57BL6 мышей 1 мин после травмы. Первоначально полученный тромбы являются нестабильными и их части, как правило, смыты потоком крови, поэтому образовавшиеся тромбы становятся меньше в 2 - 3 мин после травмы. Тромбы начинают увеличить с 3 - 4 мин после удаления фильтровальной бумаги и эти позже сформированные тромбы стабильны и, как правило, не вымываются. Средняя окклюзионные время составляет 11,3 ± 3,16 мин у мышей C57BL6 (п = 14) при 7,5% FСТЭК 3 используется 6,7,19 (рисунок 5А и онлайн - видео 1). В предыдущих исследованиях мы показали , что как уменьшение и увеличение концентрации FeCl 3 уменьшает разницу между антитромботического штамме мышей и мышей WT 6; Исходя из нашего опыта, лечение сонной артерии с 7,5% FeCl 3 в течение 1 мин достаточно , чтобы удовлетворить всех наших целей. Кроме того , чтобы проверить функцию специфических генов с использованием мышей с нокаутом 7,8,16,19,21, следующие четыре представительные эксперименты с использованием этой модели:
Внутривенное Перфузия тканевого типа активатор плазминогена опосредованного тромболизиса
Активатор плазминогена тканевого типа (ДТС) является одним из FDA утвержденных препаратов для лечения тромболизиса в Соединенных Штатах 22. Таким образом, мы наблюдали ТАП-опосредованного тромболизис в модели тромбоз сонной артерии. тромбозинициирована с 7,5% FeCl 3 и позволило сформировать в течение 5 мин перед ТАП (1 мг / кг массы тела) вливают через яремную вену катетера (22GA). Как показано на рисунке 5В и онлайн - видео 2, тромб постоянно увеличиваются и занимают около 50% от светового потока через 5 мин после травмы. Тромбы продолжал увеличить после ТАП перфузия предполагая, что ДТС не влияет на активацию тромбоцитов и агрегации. Тромболизис начал около 4 минут после инъекции ТАП. Было обнаружено, что образуются тромбы пройти вариации размера многократно в течение периода наблюдения 30 мин и без окклюзии сосудов произошло в данном случае. Эти данные ясно показывают, что ТАП не может полностью ингибировать образование тромба тромбоцит-опосредованных, даже если это приводит к тромболитической терапии. Таким образом, мы предполагаем , что будущие эксперименты , использующие -индуцированное модели артериальный тромбоз FeCl 3 может быть использован для оценки тромболитической и других адъювантной терапии , которые могут иметь важное предentative влияние на формирование тромба.
Перфузия Par4 антител мышам Угнетает Тромбоз
Протеаза активированный рецептор 4 (PAR4) является G белком рецептор (GPCR) , на тромбоциты , который активируется путем протеолитического расщепления его N-концевого exodomain 23 и в дальнейшем приводит к шагам в активации тромбоцитов. Лаборатория Nieman сформировала козьи поликлональные антитела Par4 (CAN12) , который нацелен на анионный кластер Par4, и задерживает Par4 расщепление, влияя тем самым на критический шаг для Par4 опосредованной активации тромбоцитов 24. Перфузией 1 мг / кг этого антитела мышам C57BL6, мы обнаружили , что ингибирование PAR4 расщепления значительно увеличивал раз в окклюзионная образование тромба в 7,5% FeCl 3 индуцированной сонной артерии тромбоза на экспериментальной модели (5С и онлайн видео 3). Это свидетельствует о том, что FeCl 3 индуцированный тромбоз модель сбыть использованы для оценки влияния антитромбоцитарных агентов и характеризуют потенциальные терапевтические стратегии.
Наночастицы опосредованной Тромбы-специфическое нацеливание
Быстрое удаление комок, чтобы восстановить кровоток имеет решающее значение при лечении окклюзионных сосудистых заболеваний, включая ишемический инсульт и инфаркт миокарда. Системной доставки тромболитиков, таких как ДТС показано выше, может лизировать сформированную тромбы, но не может полностью предотвратить активацию тромбоцитов и повторной агрегации / окклюзию. Кроме того, системная прямая поставка таких сериновых протеаз агентов может привести к неизбирательного действия офф-мишени, что приводит к серьезных побочных эффектов, включая кровотечения. Лаборатории Сен Гупта разработаны синтетические транспортные средства доставки тромбоцитов вдохновили на основе наночастиц , которые могут связываться с тромба-ассоциированных активированных тромбоцитов и белков при гемодинамической сдвиговом потоке 25-27. Таким образом, мы исследовали, могут ли эти наночастицы могутсвязываются с активно формирующих тромбов в артерии.
Как уже упоминалось в эксперименте для ТАП перфузией, катетер был вставлен в яремную вену и соединен с инъекционной насос для закачки наночастицу при равномерном расходе. В этом эксперименте не флуоресценции красителя впрыскивают в мышь, чтобы маркировать тромбоциты. Вместо того, чтобы наночастицы были помечены Rohdamine В; поэтому они были в состоянии наблюдать под микроскопом прижизненной. Тромбоз инициировали 7,5% FeCl 3 обработки в течение 1 мин , как уже упоминалось ранее. Так как в WT мышей, значительное количество тромбов было обнаружено, образуют через 5 мин после травмы, мы выбрали этот момент времени для введения наночастиц, чтобы обнаружить, если наночастицы эффективно связываются с активно образующих тромбы. Как показано на рисунке 5D и онлайн - видео 4, после введения флуоресцентных наночастиц, мы смогли определить форму горно-тромб, который был постепенно покрывается флуоресцентных частиц. Эти исследования демонстрируют полезность индуцированной модели тромбоз FeCl 3 , чтобы оценить способность целеполагания (и последующей терапевтической эффективности) зернистых систем доставки лекарственных средств сгустка-мишенью.
Роль красных , отличных от тромбоциты тромб формирования клеток крови.
Недавние исследования показали, что красные клетки крови (эритроцитов) играют важную роль в FeCl 3 модели индуцированной тромбоз 28 , и они являются первым приверженцем компонент крови к поврежденной стенке сосуда 29,30. Чтобы исследовать это явление, мы пометили RBCs с 1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine Хлорнокислый (разб, 10 мкМ конечная концентрация). DIL-меченные Эритроциты промывали два раза ЗФР и ресуспендировали в солевом растворе с 35% гематокрита. Дил-меченых RBC суспензию (100 мкл на мышь) инъекционныее изд в тромбоцитопенической мышей , которые были облученных летальной дозой 5 дней до начала эксперимента 19. Эти мыши имеют к тромбоцитопении значительного сокращения тромбоцитов, что увеличит шансы на РБК выжидать к стенке сосуда, если они делают. В отличие от экспериментов с использованием флуоресцентно-меченного тромбоциты (рисунок 5), не очевидно , накопление флуоресцирующих клеток обнаружено не было на стенке сосуда после повреждения сосудов (6А, онлайн v 5) идейно. Тем не менее, наряду с образованием обогащенной тромбоцитами тромбов, Эритроциты начал накапливаться в тромб , который иллюстрирует форму сгустка (Фиг.6а). Иммунофлуоресценции окрашивание поврежденной сонной артерии показал , что основные клетки , прилипшие к стенке сосуда тромбоциты (CD41 положительный, зеленый), в то время как Гомотетия меченые эритроциты, в основном , в ловушке внутри тромба (Фиг.6В & C). Эти исследования показывают, чтоFeCl 3 индуцированную модель Тромбоз может быть использована в получении механистического представление о клеточных и молекулярных компонентов и пространственно-временных событий в образовании тромба.
Mesenteric Тромбоз Модель
Для мезентериального тромбоза на экспериментальной модели, высокая концентрация FeCl 3 (10 - 12,5%) рекомендуется как сосуды обычно окружены жировой тканью, которая может препятствовать диффузии FeCl 3 в направлении стенки сосуда и , таким образом , предотвращает судно от FeCl 3 индуцированного травмы 7. Эта модель больше подходит для венозного исследования тромбоз. Как показано в онлайн - видео 6, тромб был замечен около ~ 15 сек в брыжеечной вены после местного применения фильтровальной бумаги , насыщенный 12,5% 3 раствора FeCl, но образование тромба резко задерживается в брыжеечной артерии. Среднее время на окклюзионная образование тромбов составляет ~ 17 ± 7,2 мин (п = 11) в м esenteric вены и около 23 ± 9,9 мин (п = 10) в брыжеечной артерии при 12,5% FeCl 3 используется 7.
Рисунок 1. Хирургия Инструменты. Минимальные необходимые инструменты для хирургии мыши показаны. Смотрите список материалов для получения более подробной информации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Мышь Фиксирование для хирургии. Закрепите мышь на 15 см культуры блюдо крышкой для сонной артерии модели тромбоз или для инъекции родамина 6G красителя для брыжеечной модели тромбоз.получить = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. сонная артерия Тромбоз модели. Процедуры подвергать яремную вену, инъекции родамина 6G флуоресцентный краситель в кровеносную систему и экспозиции левой сонной артерии показаны. В формуле (А), линия указывает надрез от рукоятки до уровня подъязычной кости; в (Б), синие стрелки обозначают подчелюстной железы, и желтые пунктирные линии представляют фасции между подчелюстной желез; в (С), синие стрелки указывают на подчелюстной железы, черная стрелка указывает на рукоятки, и пунктирная желтая линия указывает на положение , чтобы сократить , чтобы выставить яремную вену; в (D), синяя стрелка указывает на яремную вену; в (Е), желтая стрелка указывает на левый подчелюстной, синяя стрелка indicatэс оставил кивательной мышцы, пунктирная желтая линия указывает на лицевую панель, и зеленая стрелка указывает на лопаточно-подъязычная мышца или грудино-подъязычная мышца; в (F), синяя стрелка указывает на сонной артерии, желтые пунктирные линии показывают тонкие грудино-подъязычная мышца и / или лопаточно-подъязычная мышца; в (G), синяя стрелка указывает на сонной артерии и зеленая стрелка указывает на блуждающий нерв; в (H), синяя стрелка указывает на сонной артерии и зеленая стрелка указывает на пластиковую "U-образное" кофе мешалку; и в формуле (I), синяя стрелка указывает на фильтровальную бумагу , расположенную с 3 раствором FeCl, а зеленая стрелка указывает на сонной артерии. T указывает на трахею. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. брыжеечная артерия и вена Тромбоз модели. Облучение сосудов брыжейки, а также FeCl 3 лечение показано. В (А), синяя стрелка указывает на белой линии, Белая волокнистая ткань без судна; В (Б), рассечение вырезать в одиночку Linea альба было показано; в (С), синие стрелки указывают на вторую дугу брыжеечных артерий и вен; в (D), синяя стрелка указывает на фильтровальную бумагу , расположенную с FeCl 3 раствором. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Представитель Эксперименты с использованием сонной артерии Тромбоз модели. (А). Образование тромбов в theC57Bl / 6 мышей обрабатывали 70,5% FeCl 3. (В). ТАП опосредованной тромболитической эффекта. (С). Инъекция антитело , воздействующее на рецептор мыши тромбин PAR4 на был показан тромбоз. (D). Тромбом-ориентированные на сайты nanovehicles специфически связываются с активно образуя тромбы было показано , Inj. P указывает на инъекцию частицы; и пик В указывает на пик полосатости частиц к тромбов. Все изображения были взяты под тем же увеличением. Шкала бар = 300 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Роль RBC на тромб формации. (А) тромбоцитопеническая мышей, получавших перфузию Гомотетия меченных эритроцитах были подвергнуты сонную артерию модели тромбозе и изображений после того, как 7,5% FeCl
Видео 1: Представитель видео сонной артерии тромбоз модели дикого типа (WT) мышей. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить.) Это видео показывает формирование репрезентативной тромба в сонной артерии мышей WT индуцированного местного нанесения фильтровальную бумагу , расположеннуюс 7,5% FeCl 3 раствора. Тромбоциты были помечены путем внутривенной инъекции родамина 6G, и видео было размещено в монохромном режиме. Белая масса запекшаяся тромбоциты.
Видео 2: тканевый активатор плазминогена (ТАП) , опосредованные тромболитическая эффект обнаружен с помощью модели тромбоз сонной артерии. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить.) Тромбоциты маркировки и образование тромба было начато как упомянуто в видео 1 и ТАП вводили внутривенно через 5 мин после 7,5% FeCl 3 травмы.
Видео 3: Антитромбоцитарная наркотиков, на Mely анти-протеазы активированный рецептор 4 (PAR4) антитело, опосредованная антитромботический эффект обнаружен с помощью модели тромбоз сонной артерии. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить.) В этом эксперименте мыши получали Par4 антитела и родамина 6G инъекции за 10 мин до образования тромба было инициировано местного нанесения фильтровальную бумагу , расположенную с 7,5% FeCl 3.
Видео 4: Наночастицы опосредованной тромбы конкретным нацеливание. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить.) В этом эксперименте, образование тромба сонной артерии была начата с 7,5% FeCl 3 без маркировки тромбоцитов. Наночастицы метили родамина В и вводят внутривенно в мышь 5 мин после травмы.
Видео 5 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg "/>
Видео 5: Связывание красных кровяных клеток , обнаруженных с помощью модели тромбоз сонной артерии. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить.) Эритроциты (RBCs) были помечены 1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine перхлората (Диль, 10 мкМ конечная концентрация), и 100 мкл Гомотетия меченные эритроциты (35% гематокрита) вводили в тромбоцитопенической мышей. Нет маркировки тромбоцитов не проводилось в этом эксперименте. Тромб был инициирован как упоминалось выше with7.5% FeCl 3.
Видео 6: Представитель видео брыжеечной артерии и вены модели тромбоза на мышах WT. (Правой кнопкой клиск для загрузки.) Тромбоциты метили путем внутривенной инъекции родамина 6G, а тромб был инициирован местно после применения одного куска фильтровальной бумаги с 12,5% раствором FeCl 3 в течение 1 мин. Судно наблюдалось при 10-кратном сухой линзы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FeCl 3 индуцированную модель является одним из наиболее широко используемых моделей тромбоз, который может не только предоставить ценную информацию о генетических модификаций на функции тромбоцитов и тромбоза 7,8,16,19,31-33, но также может быть ценным инструментом для оценки терапевтических соединений и стратегий для лечения и профилактики заболеваний атеротромботических 11,17,34-37. Здесь мы показали наши изменения и уточнения этой модели и показали дополнительные доказательства полезности этого метода, который является достаточно чувствительным, чтобы определить влияние антикоагулянта (ТАП) и антитромбоцитарных препаратов (PAR4 антител). В дополнение к механистической изучению тромбоза, модель также может быть использован для изучения нанотехнологий на основе тромбов-адресной доставки лекарств. Он также может быть использован для обнаружения формирования стенки сосуда активные формы кислорода (ROS) путем инъекции флуоресцентного индикатора ROS 21.
дотошныйметоды необходимы для выполнения этих моделей. Оператор должен иметь достаточные хирургические навыки, а также глубокое понимание сосудистой и клеточной биологии в крови. Несколько ключевых точек индуцированной сонной модели тромбоз артерии FeCl 3, 6: (1) выставить достаточно длины сонной артерии (~ 5 мм) , чтобы позволить применение фильтровальной бумаги и оставить пространство для наблюдения кровотока при прижизненной микроскопии на поздней стадии ; (2) четко обнажать адвентициальных мягкие ткани вокруг сонной артерии, чтобы позволить фильтровальную бумагу связаться стенки сосуда непосредственно и производить даже травмы; (3) не подтверждают никакого механического повреждения стенки сосуда и без образования тромба перед нанесением FeCl 3 -насыщенным фильтровальной бумаги; (4) лежат в сонной артерии с куском "U" -образные черной пластмассы , чтобы отделить артерии от окружающей ткани, чтобы блокировать фоновой флуоресценции, а также для предотвращения FeCl 3 диффузии. С помощью этих стратегий, мы сформировали весьмавоспроизводимые данные с диким типом мышей C57BL / 6, и в этом штамме мышей 7,5% FeCl 3 индуцированный времени тромбоз 11,3 ± 3,16 мин (п = 14) 6,7,19. Яремной вены инъекции родамина 6G маркировать циркулирующих клеток может быть сложной задачей. В качестве альтернативы, инъекция в хвостовую вену могут быть выполнены прежде, чем обеспечить мыши на крышке 15 см Столешница. В сравнении с моделью сонная артерия, модель брыжеечной артерии и вены легче и менее хирургическим интенсивным. Однако, как уже упоминалось в разделе Результат, за счет освещения сосудов жировой ткани, брыжеечный модель тромбоз лучше для изучения венозного тромбоза, но требует большего размера выборки, чтобы минимизировать ошибку между различными мышей.
Ограничение этой модели заключается в том, что механизм не ясно, и до сих пор спорным. Первоначально механизм этой модели считается , что из FeCl 3 генерируется ROS индуцированный денудационного эндотелиальных клеток, и суbsequently привело к взрыву компонентов крови к протромботического субэндотелия, оказывать адгезии тромбоцитов, агрегации и образование тромба 6,11. При восстановлении тромбоцитов , предварительно обработанных GPVI антителом к тромбоцитопенической мышей, мы показали , что модель , FeCl 3 , зависит от тромбоцитов GPVI, и блокирование тромбоцитов GPVI резко тормозится FeCl 3 индуцированный тромбообразования 19. Этот вывод согласуется с предыдущими сообщениями 38 и предполагает , что модель FeCl 3 может быть более вероятным , чтобы имитировать патофизиологии атеросклеротической бляшки разрыва человека , опосредованную тромбоз 6. Тем не менее, несколько недавних исследований были предложены новые механизмы , включая адгезию эритроцитов к стенке сосуда, а также физико - химического эффекта FeCl 3 индуцированной агрегации белков плазмы и клеток крови 29,30. Эти новые идеи предполагают потенциальные механизмы этой модели могут быть более сложными.
По перфузией Дил-меченых эритроцитов в тромбоцитопенических мышей , а затем вызывать FeCl 3 -triggered повреждение сонной артерии с 7,5% FeCl 3, мы обнаружили , что основные клетки , прилипшие к поврежденных стенок сосудов являются тромбоциты (Рисунок 6 и онлайн - видео 5 ). Мы не обнаружили очевидную адгезию эритроцитах, а также накопление в эритроцитах тромбов, казалось, скорее всего, является результатом защемления. Наши результаты соответствуют концепции первичного и вторичного гемостаза 39. Отличие нашего наблюдения от предыдущих докладов может быть от гипоксии и гемодинамических изменений , как в исследовании Барр и его коллеги 30, где FeCl 3 получили ранения сонных артерий для сканирующей электронной микроскопии обследования были получены у мышей , которые имели левого желудочка ранее подвергшимися без помощь механического поступление свежего воздуха. Концентрация кислорода в крови и гемодинамика будет резко сократилось, как и легочная исердечной функции будут затронуты сразу после того, как грудь открыта без механической вентиляции. Кислородное голодание уже давно ассоциируется с срабатыванию прокоагулянтной пути и тромбоза 40 , а также может усиливать адгезию RBC. Другая недавняя публикация показала , что лечение сонной артерии с очень высокой концентрацией FeCl 3 (20%) в течение 5 или 10 мин приводит к стационарному концентрации FeCl 3 при ~ 50 мМ в просвет поврежденного сосуда 29 , Они , таким образом , непосредственно проникнуты 50 мМ FeCl 3 в различные компоненты крови и исследовали влияние FeCl 3 на агрегацию ех естественных условиях, что привело их предложить механизм романа, 2-фазный для действия FeCl 3 в образовании тромбов 29. Несмотря на то, довольно интересно, результаты этого исследования следует интерпретировать с осторожностью , так как она не представляет модель FeCl 3 обычно используется. В отличие от высокой концентрации ПИОл 3 (20%, 1 М , как указано в статье) и длительное лечение (5 или 10 мин), наши предыдущие исследования, а также Барр и др. показали , что 10% FeCl 3 лечение в течение 1 мин достаточно , чтобы вызвать быстрое образование тромба в окклюзионные сонной артерии в течение 7 мин 6,30. Кроме того, в большинстве экспериментов с использованием модели FeCl 3, дальнейшее низкую концентрацию FeCl 3 (5 - 7,5%) используется.
Другим ограничением этой модели является то , что вследствие сильного окислительного повреждения эндотелия, а также эндотелиальной оголение после FeCl 3 лечения, эта модель может быть не правильный инструмент для изучения эндотелиальной воспаления , ассоциированного тромбоза. Тем не менее, при использовании этих методов для подготовки сонной артерии в сочетании с перфузией флуоресцентно меченных лейкоцитах, мы можем проверить адгезию и перекатывание лейкоцитов на воспалительный эндотелии 41.
В Суммичных, мы усовершенствовали и стандартизировали -индуцированное модели повреждения сосудистой FeCl 3 , чтобы получить хорошо воспроизводимый травму на сонной артерии и время прекращения количественного кровотока точно с помощью прижизненной микроскопии. Эта модель достаточно и чувствительны для того чтобы испытать антикоагулянт и антиагрегантов, а также подходит для исследований тромбов ориентированных на наномедицины. В сочетании с трансплантацией костного мозга, тромбоцитов вливания в тромбоцитопенической мышей или прямой внутрисосудистой инъекции препаратов - кандидатов, мы показали , что это является удобным, простым и чувствительным инструментом для исследования тромбоз в естественных условиях 7-10,16,19,42,43 ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14502-14 | cut and hold skin |
| Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | cut and hold skin |
| Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm | Fine Science Tools | 14519-14 | to dissect and separate soft tissue |
| Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm | Fine Science Tools | 13021-12 | to dissect and separate soft tissue |
| Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm | Fine Science Tools | 11050-10 | to dissect and separate soft tissue |
| Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm | Fine Science Tools | 11254-20 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm | Fine Science Tools | 11253-10 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter | Fine Science Tools | 10062-12 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12061-02 | Needle holders |
| Suture Thread 4-0 | Fine Science Tools | 18020-40 | For fix the incisors to the plate |
| Suture Thread 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | For all surgery and ligation |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| rhodamine 6G | Sigma | 83697-1G | To lebel platelets |
| FeCl3 (Anhydrous) | Sigma | 12321 | To induce vessel injury |
| Papaverine hydrochloride | Sigma | P3510 | To inhibit gut peristalsis. |
| Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes | Medline | 111625 | To fix the mouse to the plate |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm | Fisher | 09-720-004 | For sterlization of solutions injected to mice |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm | Fisher | 09-719D | To filter the FeCl3 solution |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisher | 06-669-62 | To sterilize the surgical site |
| Agarose | BioExpress | E-3120-500 | To make gel stage |
| Leica DMLFS fluorescent microscope | Leica | Intravital microscope | |
| GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. | npi electronic GmbH | http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html | |
| Streampix version 3.17.2 software | NorPix | https://www.norpix.com/ |
References
- Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
- Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
- Ruggeri, Z. M.
- Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C.
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
- Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
- Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
- Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
- Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
- Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
- Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
- Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
- Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
- Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
- Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
- Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
- Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
- Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
- Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
- Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
- Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
- Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
- Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
- Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
- Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
- Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
- Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
- Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
- Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P.
- Cooley, B. C.
- Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
- Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
- Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H.
- Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
- Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
- Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
- Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).
