HIV-1複製サイクルの統合後のステップを標的とするRNA分子の有効性と毒性を評価する方法が説明されています。これらの方法は、新しい分子をスクリーニングし、既存の分子のフォーマットを最適化するのに役立ちます。
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この記事について
サマリー
要約
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概要
現在のHIV-1治療の限界は、それらが慢性疾患の進行を予防するために投与しなければならないことです。 HIV-1抵抗性Tリンパ球または造血幹細胞の移植、薬物療法1,2の非存在下でHIV-1複製の長期制御を提供する可能性があり、また、HIV-1の硬化を達成するのに有効なアプローチであり得ます3。 HIV-1複製に耐性細胞をレンダリングするための一つの方法は、自己移植4中に感染した個体の細胞内への抗HIV-1のRNAまたはペプチドをコードする1つ以上の遺伝子を挿入することです。いくつかの候補の抗HIV-1遺伝子は、任意の単一遺伝子をHIV-1抵抗性の発達を防止するために、2つの5または三6の組み合わせでいくつかの入力の臨床試験を用いて設計されています。
抗HIV-1 RNAは、免疫応答を誘発するそれらの低電位による組み合わせ遺伝子治療のために、彼らため上位候補の一つであります非常に短い遺伝子配列から転写されます。いくつかの抗HIV-1 RNAは、ウイルスの侵入及び統合を標的とするように設計されています。しかし、ほとんどの抗HIV-1 RNAは、ウイルスのライフサイクルの後の積分ステップ（ 図1）を標的とします。統合後の阻害剤は、このようなリボザイム7、shRNAは8とU1i RNAを9....
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プロトコル
1.細胞およびトランスフェクション
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養HEK 293T細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。細胞培養培地中の2×10 5細胞/ mlの懸濁液を調製します。それぞれ、ウイルス産生のために、24ウェル、96ウェル、12ウェルプレートの各ウェルに細胞の生存および免疫活性化アッセイ細胞懸濁液の500、100〜1,000μLを加える（ 図2A）。
- 静かにプレートを旋回し、5％のCO 2で37℃でO / Nそれらをインキュベートします。百分の50から70の密集度に細胞を増殖させます。
- トランスフェクションの計画によると、1.5ミリリットルのマイクロチューブ（例、 図2B）に試験RNAおよびそのコントロールの希釈液を準備します。
- ウイルス産生アッセイのために、HIV-1発現プラスミド10ngの/μlの希釈を準備し、各チューブに10μlを添加します。次の5μMの試験RNAの希釈液および陰性対照RNを準備A. 25または100 nMの最終濃度のために、対応するチューブに各試験RNAおよび陰性対照希釈の2.5または10μLを加えます。
- C：細胞生存率アッセイのために、試験RNAおよびポジティブコントロールRNA、低分子量ポリIの10 mg / mlで....
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結果
手順の一般的な概略図は、3つの試験RNAおよび図2Bに設けられたコントロールRNAのための例示的トランスフェクション計画を図2に示されています。ウイルスの産生および細胞生存率アッセイのために、各試験構築物のための読み出しは、陰性対照に正規化されます。各試験RNAは、その隣接する負の対照に対して標準化されるように複製が、セットでトランスフェクトされます。これは、例えば、陰性対照のすべてが最初にトランスフェクトされ、場合に生じ得る、複合体およびトランスフェクションの間の時間に関連した不正確なデータを避けるために行われています。 HIV-1は、免疫応答27,28に影響を与えることができるので、細胞の生存および免疫活性化アッセイは、HIV-1を発現するプラスミドの添加なしに行われます。
HIV-1 RNA（位置1498から1415で保存された部位を.......
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ディスカッション
HIV-1産生アッセイを説明11,31標的部位をHEK293T細胞（ 図2）を使用して実施し、効果的なリボザイム13、shRNAを10,29のためのHIV-1 RNAをスクリーニングするために使用されるアッセイと類似して、siRNAの30、及びU1i RNAました。 HIV-1産生を定量するために異なる方法を使用して、ほとんどの研究は、候補RNAとHIV-1発現プラスミドのコトランスフェクションした後、ウイルス産生の48時間を測定しました。 HIV-1の産生に続いて、未成熟ビリオンは、新しい細胞に感染することができる成熟ビリオン、となるようにHIV-1プロテアーゼによるそのポリタンパク質のタンパク質分解的切断を受けます。工程2.2に記載のHIV-1 RT酵素活性アッセイのために。 RT酵素が成熟ビリオンでのみアクティブになりますので、2.5に。、生産および成熟段階の両方が、評価されます。対照的に、カプシドタンパク質及びウイルスのRNAの両方の成熟と未成熟ビリオン中に存在してもよいです。したがって、p24のELI.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
ここで紹介する作品は、（AGにDCB-120266、PPP-133377およびHBF-348967を付与）健康研究（CIHR）のカナダの研究所によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| 細胞培養プレート、96 ウェル、24 ウェル、6 ウェル。 | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| 低分子量 Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | 合成RNA用トランスフェクション試薬 |
| TransIT-LT1 | Mirus MIR | 2300 | RNA発現プラスミド |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| オリゴ(dT)<サブ>12-18 DNAプライマー | サーモフィッシャー | 18418-012 | |
| DEAE フィルターマット紙 | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| マイクロプレートシンチレーションカウンター | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| マイクロプレート分光光度計 | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 |
| 微量遠心分離機 | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford 試薬 | Bio-rad | 500-0006 | |
| ゲルランニングチャンバー | Hoefer | SE600 | |
| セミドライトランスファーセル | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| ニトロセルロースメンブレン | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| 抗体ストリッピングソリューション | ミリポア | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | ||
| ADAR1 抗体 | . B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin 抗体 | ミリポア | MAB1501 | |
| ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ | KPL | 474-1506 | |
| ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス | KPL | 474-1806 | |
| ポンソーS | シグマ-アルドリッチ | 6226-79-5 |
参考文献
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50(2015).
- Allers, K., et al....
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