We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.
Til tross for evne til reproduksjon av skjelettmuskulatur, permanente funksjonelle og / eller kosmetiske underskudd (f.eks volumetrisk muskel tap (VML) som følge av traumatiske skader, sykdom og ulike medfødte, genetiske og ervervede forhold er ganske vanlig. Tissue engineering og regenerativ medisin teknologiene har enorm potensial til å gi en terapeutisk løsning. Men bruk av biologisk relevante dyremodeller, i kombinasjon med langsgående vurderinger av relevante funksjonelle tiltak er kritisk for utvikling av forbedrede regenererende terapeutika for behandling av VML-lignende skader. i den forbindelse, et kommersielt muskel spak system kan brukes til å måle lengde, spenninger, styrke og hastighetsparametre i skjelettmuskel. Vi brukte dette system, i forbindelse med en høy effekt, bi-fase stimulator, for å måle in vivo kraft produksjon som reaksjon på aktivering av den fremre crural rommet rotte bakben. Vi har Previgere brukte dette utstyret for å vurdere den funksjonelle virkningen av VML skade på tibialis anterior (TA) muskel, så vel som omfanget av funksjonell restitusjon etter behandling av de skadde TA muskelen med vår vev konstruert muskelreparasjon (TEMR) teknologi. For slike undersøkelser, blir den venstre foten av en bedøvet rotte godt forankret til en fotplate koblet til en servomotor, og den felles peroneal nerve stimuleres av to perkutan nålelektroder for å fremkalle muskelsammentrekning og bøyning til flere sider av foten. Peroneal nervestimulering-indusert muskelkontraksjon måles over et område av stimulerings frekvenser (1-200 Hz), for å sikre at en eventuell platå i kraft produksjon som gir mulighet for en nøyaktig bestemmelse av topp tetanic kraft. I tillegg til vurderingen av omfanget av VML skade, så vel som graden av funksjonell restitusjon etter behandling, kan denne metoden kan lett brukes til å studere forskjellige aspekter av muskel fysiologi og patofysiologi. En slik tilnærming should bistå med mer rasjonell utvikling av bedre terapi for muskel reparasjon og regenerering.
Skjelettmuskulatur har en bemerkelsesverdig indre kapasitet for reparasjon som respons på skade eller sykdom 1,2. Eksperimentelt, har robustheten denne regenerativ respons er godt dokumentert i dyremodeller ved å studere, for eksempel, den tiden løpet av skjelettmuskelskader, reparasjon og regenerering etter påføring av myotoxins (f.eks Cardiotoxin) 3-7. Mer spesifikt, etter omfattende Cardiotoxin-indusert muskelskader (38-67% av muskelfibre 8), er regenerering formidlet av satellittceller, bosatt stamceller som modnes til slutt bli funksjonelle muskelfibre 4,9-13. Sluttresultatet er økt etter skade funksjonell regenerering av sunt, kraftproduserende muskelvev 14-16. Selv om detaljene er godt utenfor rammen av denne rapporten, den mekanistiske grunnlaget for muskelregenerasjonenen reflekterer nøye orkestrert hendelsene i mange celletyper fra flere linjene benytter canonical signalveier kritisk til både vev utvikling og morphogenesis 5,17-21. Viktigere er myotoxin-indusert regenerering aktivert av det faktum at den ekstracellulære matriks, neuronal innervasjon og blodkar perfusjon forbli strukturelt intakt etter Cardiotoxin-indusert muskelskade 3,8,22. I sterk kontrast til disse viktige vev strukturer og komponenter er, per definisjon, helt fraværende i sammenheng med VML skade; hvor frank tap av vev, på grunn av en rekke årsaker, resulterer i faste funksjonelle og kosmetiske underskudd 23-25.
Uavhengig av de ekstra utfordringer knyttet til muskel reparasjon og regenerering etter VML skade sammenlignet med myotoxin-indusert muskelskader, bedre forståelse av mekanistiske grunnlaget for skjelettmuskulatur regenerering og reparasjon, i en rekke sammenhenger, ville være godt tjent med utnyttelse av biologisk relevante dyremodeller, i kombinasjon med langsgående enssessments av relevante funksjonelle tiltak. Som omtalt heri, studier av rotte bakben gir en utmerket modellsystem for dette formål. Mer spesifikt, musklene i fremre crural rommet (tibialis anterior, extensor digitorum longus (EDL) og hallicus longus (HL)), som er ansvarlig for bøyning til flere sider av foten, er lett identifisert og manipulert. Videre er de tjent med store blodårer (bekken og grener), og er innervated av nerver (hofte og grener, inkludert peroneal) kjører lengden på beinet 26-28. Som sådan kan man bruke rotte bakben modell for direkte å vurdere skjelettmuskelfunksjon / patologi in vivo, eller for å evaluere mer indirekte påvirkning av patologi relaterte endringer i blodårer eller nerver på tilsvarende skjelettmuskelfunksjon. I begge tilfeller kan alvorlighetsgraden av sykdommen, så vel som effekten av behandlingen bestemmes som en funksjon av muskelkraft produksjon (moment) og tilhørende fot movement 29-34.
Ideelt sett er kraftmålinger ledsaget av histologiske studier og genuttrykk analyser til mer grundig vurdere strukturelle og molekylære status av skjelettmuskulatur. Grunnleggende histologi og immunhistokjemi, for eksempel, er i stand til å svare på spørsmål om muskelstørrelse, muskelfiberinnrettings, ekstracellulær matrise-blandingen, plassering av kjerner, cellenummer, og protein lokalisering. Genekspresjonsanalyser, i sin tur, er nødvendig for å identifisere de molekylære mekanismer som kan påvirke / modulerer modenhet av muskelfibrene, sykdomstilstander og metabolske aktivitet. Selv om disse metodene gir viktig informasjon, de vanligvis representerer terminalpunktene, og viktigst, de ikke klarer å direkte adresse funksjonsevne av skjelettmuskulatur, og dermed er samsvarende snarere enn utløsende. Men når histologiske studier og genuttrykk analyser vurderes i forbindelse med funksjonell Måltes, da, mekanismer for styrkeproduksjon og funksjonell regenerering kan mest nøyaktig identifisert.
I denne forbindelse, kan den kraft som fremkallende egenskaper av en muskel kan måles in vitro, in situ eller in vivo. Alle tre fremgangsmåter har både fordeler og begrensninger. I et in vitro eksperiment, for eksempel, er den muskel fullstendig isolert og fjernet fra kroppen til dyret. Ved å fjerne påvirkning av blodårer og nerver som forsyner muskelen, kan den kontraktile evne til vev bestemmes på en kontrollert ytre miljø 35. In situ muskeltesting tillater at muskel å være isolert, som med in vitro-preparater, men den innervasjon og blodtilførselen forblir intakt. Fordelen med in situ eksperimentelle modellen er at den tillater en person muskel til å bli studert mens innervasjon og blodtilførselen er minimal opprørt 36. I beggein vitro og in situ forsøk, kan farmakologisk behandling påføres mer direkte, uten å måtte ta hensyn til virkningene av alle omkringliggende vev eller virkningen av sirkulasjonssystemet for de målte kontraktile responser 37. Imidlertid in vivo funksjonstesting, som beskrevet heri, er den minst invasiv teknikk for vurdering av muskelfunksjon i dets native miljø 38, og kan utføres gjentatte ganger over tid (dvs. i lengderetningen). Derfor vil det være det sentrale punktet i diskusjonen nedenfor.
I denne forbindelse, perkutane elektroder innsatt nær den muskel av interesse, eller den motor nerve som betjener det, tilveiebringe et elektrisk signal til muskelen. En svinger måler deretter den resulterende lengde eller kraft endringer i den aktiverte muskelen som anvist av en forhåndsbestemt, tilpasset programvare protokollen. Fra disse data kan de fysiske egenskapene til muskel bestemmes. Disse inkluderer force-frekvens, maksimal stivkrampe, kraft-hastighet, stivhet, lengde spenning og tretthet. Muskel lengde eller kraft kan også holdes konstant slik at muskelen kontrakter isometrisk eller isotonisk. Viktigere, kan disse eksperimentelle protokoller hurtig bli utført, lett gjentatt, og customized- samtidig som dyret er bedøvet, og med en hvileperiode på timer til dager. En enkelt dyr kan gjennomgå in vivo kraft testing av flere ganger, og dermed gjør longitudinelle studier av sykdomsmodeller eller evaluering av terapeutiske plattformer / teknologier.
Som beskrevet her, et kommersielt muskel spak system i forbindelse med en høy effekt, er tofase-stimulator som brukes til å utføre in vivo muskelfunksjon tester for å evaluere bidraget av tibialis anterior muskel av rotte bakben til bøyning til flere sider av foten via stimulering av peroneal nerve. Vi har utviklet en protokoll som er spesielt utformet for å evaluere regenerativ medisin / tissue engineering teknologier for muskel reparasjon følgende traumatisk VML skade av rotte TA muskelen. Det bør merkes; EDL og HL trenger å bli dissekert ut fra det fremre kammer crural for spesifikt å evaluere TA muskelen (de utgjør omtrent 15-20% av den totale tibialis anterior moment målt følgende peroneal nervestimulering (Corona et al., 2013) ). Fordi denne tilnærmingen gir omfattende langsgående analyse av muskelfysiologi / funksjon, kan det kaste viktig mekanistisk innsikt på en rekke andre typer fysiologiske undersøkelser samt en rekke sykdommer eller terapeutiske områder 39. For eksempel in vivo-muskelfunksjon testing er anvendelig for studier av treningsfysiologi, iskemi / reperfusjon forskning, myopati, nerveskader / neuropati og blodåresykdom, sarkopeni, og muskeldystrofier 40.
Denne protokollen viser en forholdsvis enkel fremgangsmåte for å utføre in vivo muskelfunksjon testing på den fremre crural rommet på rotte med bakbena. Andre former for muskelfunksjonen testing, inkludert ex vivo og in situ-protokoller kan også gi viktig informasjon om muskelfysiologi. Imidlertid er betydningen av in vivo funksjonsprøving ligger i dens ikke-invasive natur, og det faktum at den mest nøyaktig sammenfatter endogene mekanismer for muskelstimulering. Både ex vivo og in-situ-testing, sene og / eller muskel er utsatt, og derfor må holdes fuktig eller neddykket 41,42. In vivo-testing fjerner ledsagende variabler av trauma og betennelse som kan være forårsaket av de kirurgiske prosedyrene som kreves for in situ muskelfunksjon testing; Dette er spesielt viktig hvis målet med forsøket er å undersøke inflammatorisk og cellulære prosesser <sopp> 43. Videre er in vivo-testing krever lite kirurgisk dyktighet som muskelen ikke er isolert fra omgivelsene og ikke krever presise knuter for å redusere muskel / sene glidning (som er tilfellet for in situ eller ex vivo testing) 41. I tillegg, med tilstrekkelig praksis, hastigheten av korrekt plassering av elektrodene og evnen til raskt å foreta justeringer for å oppnå maksimal styrke produksjon av muskelen vil sikre at protokollen gjennomføringen er hurtig og reproducible- både i dyr og på tvers av ulike brukere av samme utstyr 39 . Det er gunstig å begynne med en vurdering av hele fremre crural komponent som vist, før fjerning av de mindre tilgjengelige synergis muskler (EDL og HL) for mer direkte undersøkelse av TA-muskelen. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan man ganske raskt oppnå mestring av teknikk. Mens prosedyren beskrevet her demonstrerer og fremhever nytten av en kraft frfrekvensskiftnøklede protokollen til å indusere stivkrampe og bestemme den maksimale kraft produsert av en muskel, bør brukerne bestemme type (r) av funksjonelle tester som ville best informere sine spesifikke eksperiment (er) og forskningsmål.
Det er flere kritiske trinnene som skal utføres nøye for å sikre optimal og reproduserbar eksperimentelle resultater, det vil si i samsvar maksimal kraft produksjon av muskelen til en rekke forskjellige stimuleringsparametere. Flere av de viktigste funksjonene er skissert i figur 2. Men riktig plassering og stabilitet av stimulerende elektrode er en absolutt forutsetning for reproduserbar maksimal stimulering av peroneal nerve. I denne forbindelse bør elektrodene være plassert på overflaten. Det vil si, hvis elektrodeplasseringen er for dypt, risikerer en direkte elektrisk stimulering av antagonist muskler, og dermed minske størrelsen av den observerte kontraktile respons av fremre crural rommet. Videre,to elektroder bør plasseres i så nær hverandre som mulig for å redusere den elektriske motstand i den omgivende hud og bindevev. Generelt elektrode posisjonering nær kneet og mediale til benet direkte tracing kanten av tibialis anterior til hvor den møter gastrocnemius gir ofte tilstrekkelig kraft produksjon. Dette sikrer også at elektrodene er plassert tilstøtende og vinkelrett på planet til peroneal nerve, som i sin tur løper vinkelrett på skinnebenet og sideveis ned i benet fra kneet. Men den naturlige variabiliteten i anatomi mellom dyr krever konstant årvåkenhet for å sikre at plassering av elektrodene er optimalisert på sak-til-sak basis. Som sådan, er det en viss grad av prøving og feiling i forbindelse med plassering av elektroder som er betydelig redusert av den erfaring av brukeren. Antall ganger elektrodene pierce huden bør minimaliseres for å redusere hevelse og betennelse, noe som reduserer megasured styrkeproduksjon. Dette er avhengig av hvor nålene er opprinnelig plassert, men det anbefales å flytte nålene to ganger eller mindre spesielt i området rundt kneskålen. Til slutt, når elektrodene er plassert i benet av dyret, mindre justeringer kan gjøres til posisjoneringen av benet og strømmen levert gjennom elektrodene. Dette bør gjøres samtidig med overvåking av den kraft som produseres fra en enkelt rykk. I tillegg til plassering av elektrodene, kan justeringer også gjøres til spenningen levert over elektrodene. Men i oppsettet som er beskrevet her, er det viktig å være forsiktig når du øker spenningen som en måte å øke kraft produksjonen fordi den økte spenningen vil stimulere nerver som innerverer antagonistiske muskler.
Det er tre viktige tekniske spørsmål som må overvåkes for å sikre at elektrodeplasseringen forblir optimal. Først må foten av dyret bedøvet være forsvarligforankret til fotpedalen apparat, som måler muskelkraften produksjon (figur 2). Hvis foten ikke er godt forankret, kan den sanne kraft produsert av muskelen bli ufullstendig oversatt til styrken svinger. Ustabil fot fiksering innfører også risikoen for å miste den optimale plassering av elektrodene som bevegelse utover normal muskelkontraksjon (dvs. foten beveger seg bort fra fotplaten) kan forårsake forskyvning av elektrodene fra deres overfladisk stilling eller løsne dem helt. Begge scenario vil redusere den målte kraft. For det andre bør dyrets kropp være helt liggende og justert i en rett plan (figur 2). Riktig plassering av dyr kroppen hindrer små bevegelser i bena på grunn av respirasjon, og minimerer også vridning av beinet og bekken, slik at bedre plassering og løpende kontakt med de stimulerende elektroder. Tredje, korrekt posisjonering og forankring av kneet er Critical for å sikre at benet forblir stabil, og dermed bidrar til å stabilisere den optimale plassering av de stimulerende elektroder for å muliggjøre konsistent aktivering av peroneal nerve.
Det er noen flere punkter som bør vektlegges. For det første er det kommersielle muskelen spaken system som er utformet for å utføre tester på venstre ben, men oppsettet kan modifiseres til å utføre testing på den høyre benet i tillegg. For det andre kan muskelspaksystemene bli valgt basert på størrelsen av dyret, slik at brukere skal sikre at plattformen som anvendes er tilstrekkelig til å måle og understøtte den kraft som frembringes av dyremodell av valg. Prøvbare muskler for utstyret plattformen er begrenset til de som induserer plantar forlengelse eller dorsalfleksjon av foten. For det tredje bør det igjen understrekes at elektrodeplasseringen kan være utfordrende og krever tålmodighet og praksis for å mestre teknikken. Elektroder også bli kjedelig raskt med regelmessig bruk, så det er nyttig å ha flere reserve sets for når det blir vanskelig å stikke huden overfladisk. Tredje, protokoll beskrevet i denne rapporten benytter spesielle stimuleringssekvenser og dataanalyse prosedyrer. Muskelen spaken system kontroll programvare og dataanalyse programvare og dataene den gir kan svare på mange andre eksperimentelle spørsmål og derfor utvider sin nytteverdi utover det som er skissert her. Som sådan, er brukere oppfordres til å utforske utover grensene for programvareprotokoll (s) presentert i denne artikkelen. Til tross for disse mindre begrensninger, in vivo muskelfunksjon testing er en kraftig metode for å bestemme helse- og kontraktile egenskaper av skjelettmuskulatur, fordi det er minimal invasiv og kan utføres på flere anledninger, over en lengre tidsperiode, på det samme dyret. Kort sagt, denne typen service på verktøyet gjør systemet spesielt flinke til å teste effekten av nye behandlingsformer for muskel-skjelettlidelser skade eller sykdom hos rotter bakben.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.
Isothesia | Henry Schein Animal Health | 05260-04-04 | |
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill | Vet Equip | 911103 | |
Inlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911124 | |
Outlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911125 | |
Tabletop Anaesthesia Machine | Vet Equip | 901801 | |
Compressed oxygen gas | Praxair | N/A | |
VaporGuard Activated Charcoal Filter | Vet Equip | 931401 | |
T/Pump Professional water heater | Stryker | N/A | set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature |
Transpore Surgical Tape | 3M | 1527S-1 | rip in half to make thinner strips |
A5 Golden animal clippers | Oster | 078005-050-002 | |
Povidone-Iodine Solution | Aplicare | 82-227K | |
Alcohol Swabs | |||
200 proof Ethanol | Decon labs | diluted to 70% with deionized water | |
cotton tipped applicators | Puritan | 836-WC | |
Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode | Chalgren Enterprises | 111-725-24TP | |
servomotor | Cambridge Technology | Model 6650LR | |
Dual Mode Lever System | Aurora Scientific Inc | Model 305C-LR-FP | contact manufacturer to order |
Signal Interface | Aurora Scientific Inc | Model 604A | |
High-Power, Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc | Model 701C | |
Data analysis software | Aurora Scientific Inc | DMAv5.110 software | |
Muscle lever system control software | Aurora Scientific Inc | DMCv5.400 software |