以下方案描述了用于定量测定离体工作大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸氧化速率的缓冲液的配制与使用方法。同时讨论了样品分析和数据解读所采用的方法。
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本文内容
摘要
摘要
哺乳动物心脏是ATP的主要消耗器官，需要持续供应能量底物以维持收缩功能。因此，心肌代谢的改变与收缩功能障碍及心力衰竭的发生密切相关也就不足为奇。揭示代谢与收缩功能之间的关联，将有助于阐明心脏在疾病状态下适应性或失代偿性变化的部分机制。离体工作大鼠心脏制备技术可用于实时、同步监测心脏收缩功能以及能量底物进入氧化代谢途径的流量。本实验方案旨在详细描述用于制备和使用缓冲液的方法，以定量测定葡萄糖和脂肪酸（心脏主要能量底物）的氧化速率。同时讨论了样品分析与数据解读所采用的方法。简而言之，该技术基于向心脏灌注 14C-放射性标记的葡萄糖和一种 3H-放射性标记的长链脂肪酸 离体 通过常温晶体液灌注维持跳动的心脏。 14CO2 和 3H2O，这些供能底物在酶促反应中产生的终末产物，随后从冠状窦流出液中被定量回收。结合所用放射性标记底物的比活性数据，即可分别定量测定葡萄糖和脂肪酸在氧化途径中的通量。利用适当的记录设备，可同时测定离体心脏的收缩功能，并将其直接与代谢通量数值进行关联分析。该技术对于研究在不同应激条件下（如前负荷和后负荷改变、缺血、药物或循环因子作用）或基因产物表达改变后，代谢与收缩功能之间的关系极为有用。
引言
临床相关性
在哺乳动物心脏中，氧化代谢途径中的底物通量、ATP生成与心脏做功之间存在显著的正相关关系1。在过去二十年中，对心脏代谢与功能之间复杂联系的研究表明，在不同类型的心脏疾病背景下，心脏代谢的改变是导致收缩功能障碍以及可能引发病理性结构重塑的原因2-4。因此，深入理解应激心脏代谢重构的调控机制，有望发现用于预防或治疗心力衰竭的治疗靶点5-7。美国心脏协会近期发布的关于"评估心脏代谢"的科学声明，凸显了科学界对该研究领域日益增长的关注8。尽管心脏成像技术的进步现已能够快速、准确地评估心脏形态与功能，但心脏代谢的体内研究仍受限且操作繁琐：核磁共振（NMR）波谱技术和正电子发射断层扫描（PET）成像可用于监测心脏高能磷酸盐代谢及三羧酸循环活性，但这些技术存在运行成本高昂、且无法在稳态条件下确定不同底物对氧化代谢贡献程度的局限性9。迄今为止，离体工作心脏模型仍是唯一可同时实时研究收缩功能与底物进入氧化代谢途径通量的技术7,9。以下实验方案旨在为制备和使用试剂提供指导，以测定离体工作大鼠心脏中底物利用速率。
离体工作大鼠心脏装置
尽管该技术已有近半个世纪的历史，离体工作大鼠心脏制备法仍然是....
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方案
注意：所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）《公共卫生服务动物照护与使用政策》进行，并经密西西比大学医学中心机构动物照护与使用委员会批准。涉及放射性同位素使用的各项操作均经密西西比大学医学中心辐射安全办公室批准，并严格遵循其规定执行。
1. 储存用缓冲液和试剂的制备
- Krebs-Henseleit (KH) 缓冲液储备溶液
- 配制 2 L 的 20 倍浓缩盐储备液，其成分（单位：mol/L）为：2.37 NaCl、0.0948 KCl、0.0236 KH2PO4 和 0.0236 MgSO4·7H2O。使用孔径为 0.45 µm 的滤器过滤，并在室温下保存，最长可保存 1 个月。
- 配制 2 L 的 20 倍浓缩（0.5 mol/L）NaHCO3 溶液。该溶液可在室温下长期保存。
- 配制 250 ml 的 1 mol/L CaCl2 储备液。使用孔径为 0.45 µm 的滤器过滤，并在室温下保存，最长可保存 1 个月。
- 将阴离子交换树脂从氯化物形式转化为氢氧化物形式
- 通过将树脂重悬于 1 L 超纯水中进行洗涤。待树脂沉降后，倾去上清液。重复此步骤 4 次。
- 将树....
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结果
下图描述了两个代表性实验。在这两个实验中，均采用前述方案制备的KH缓冲液，对16周龄雄性Sprague Dawley大鼠的心脏进行离体工作模式灌流。在每个实验中，心脏均受到某种应激条件处理以影响其做功。通过将压力传感器插入主动脉管路连续记录脉压，并测定心脏功率，以评估心肌收缩功能。同时通过测定葡萄糖和油酸氧化速率，确定每种应激条件对能量底物利用的影响。
在第一次实验中，通过将后负荷增加40%（通过手动升高主动脉溢流室实现）并在灌注缓冲液中添加肾上腺素（1 µmol/L），在接近生理负荷条件下灌注20分钟后模拟了工作负荷的急性增加（图3A）。心率可通过脉搏压曲线上收缩压峰值之间的时间间隔测定，在工作负荷骤增后立即上升超过50%（图3B）。在工作负荷增加时，心脏做功提高了40%以上，同时葡萄糖和油酸氧化速率均上升（图3C）。结果表明，在急性工作负荷增加的应.......
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讨论
前述方案详细描述了在离体工作大鼠心脏中同时定量测定葡萄糖氧化和脂肪酸氧化底物通量的方法。随后可将这些测量结果与记录的心脏功能参数叠加，以确定在基础状态和应激条件下（如负荷变化、缺血-再灌注）底物代谢与心脏做功之间的关系。 等等……还可以评估诸如心力衰竭和糖尿病等既往疾病状态对代谢与收缩功能关系的影响。此外，可利用基因修饰啮齿类动物的心脏来探究特定蛋白质对心肌代谢和功能的作用。最后，这些参数还可用于单独测试药物及其他循环因子的影响。由于葡萄糖经糖酵解的通量并不总是与葡萄糖氧化速率相关，因此在单次实验条件下同时监测葡萄糖在两条通路中的代谢速率可能更具信息价值。
糖酵解速率可通过向灌注缓冲液中添加[5-3H]葡萄糖来测定，因为3H2O的释放由糖酵解过程中烯醇化酶步骤的活性决定20。 alternatively，可使用[2-3H]葡萄糖，其在糖酵解途径的磷酸葡萄糖异构酶步骤中产生3H2O，以检测心肌对葡萄糖的摄取速率
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为 R00 HL112952（授予 R. H.）、R01 HL108618（授予 J.P.G.）、P01 HL051971 和 P20 GM104357。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钠（NaCl） | Fisher Scientific | BP358 | |
| 氯化钾（KCl） | Fisher Scientific | BP366 | |
| 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| 七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）4*7H2O | Fisher Scientific | M63 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | Fisher Scientific | S233 | |
| 氯化钙（CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 树脂，氯离子型，100 - 200 干燥目数，500 g | Bio-Rad | 1401441 | 此物品可通过直接购买氢氧化物形式来替换 （参见下文参考文献），但成本将高出近8倍 |
| AG 1-X8 树脂，氢氧型，100 - 200 干燥目数，100 g | 伯乐（Bio-Rad） | 1432445 | 购买此物品可省去将阴离子交换树脂从氯化物形式转化为氢氧化物形式的步骤（见方案第1.2节） |
| 玻璃微分析真空过滤器支架 | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Fisher Scientific | S318 | 腐蚀性物质。请查阅产品材料安全数据表（MSDS），以获取正确的操作和储存方法。 |
| 带烧结圆筒的气体分散管 | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin 牛血清白蛋白 无脂肪酸，粉末状 | EMD Millipore | 820027 | 建议使用活性炭脱脂的BSA，因为其他纯化工艺（如冷乙醇分级沉淀）可能会残留对心脏有毒性的物质。 |
| 油酸钠 | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| 油酸，[9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | 放射性物质。请遵循所在机构辐射安全办公室关于订购和操作的指导方针。 |
| 透析膜管，29 mm 直径 | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| 葡萄糖，D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | 放射性物质。请遵循所在机构辐射安全办公室关于订购和操作的指导方针。 |
| Humulin R U-100 | 礼来公司 | NDC 0002-8215-01（HI-210） | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | 美国缉毒局（DEA）管制物质第三类 |
| 3-0 丝线黑色编织线 | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10x 氢氧化苄基二甲基十二烷基铵 | PerkinElmer | 6003005 | 剧毒，可引起严重灼伤。请查阅产品材料安全数据表（MSDS），以获取正确的操作与储存方法 |
| 20 ml 玻璃闪烁瓶 | Fisher Scientific | 03-341-25E | 使用玻璃小瓶以实现定量回收 14CO2 |
| 20 ml HDPE 闪烁瓶 | Fisher Scientific | 03-337-23B | 使用HDPE小瓶进行定量回收 3H2O |
| 红色橡胶套管塞 | Fisher Scientific | 14-126DD | 20 mL 闪烁瓶；可重复使用 |
| BD PrecisionGlide 针头 23G × 40 mm | BD | 305194 | 用于通过CO的橡胶套管塞注入高氯酸2 陷阱 |
| 高氯酸，60% | Fisher Scientific | A228 | 具有强腐蚀性，可能起氧化剂作用和/或引起爆炸危险。请查阅产品材料安全数据表（MSDS）以获取正确的操作和储存方法 |
| Ultima Gold，闪烁液混合物 | PerkinElmer | 6013327 | |
| 玻璃棉 | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean 洗涤剂粉末 | Fisher Scientific | 04-355 | 用于玻璃器皿、塑料部件和管路的清洗 |
| Alconox Tergazyme 酶活性粉状清洁剂 | Fisher Scientific | 16-000-115 | 用于清洗 "难以到达" 被脂肪酸-BSA 残留物污染的表面（管路、玻璃器皿） |
参考文献
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signalin....
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重印与许可
