विजुअल chemotaxis assays कैसे कोशिकाओं chemoattractant की मध्यस्थता दिशात्मक सेल प्रवास पर नियंत्रण का एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक हैं। 1) वास्तविक समय, कई chemotaxis assays के उच्च संकल्प निगरानी, और 2) एक साथ chemoattractant ढाल visualizing और न्यूट्रोफिल की तरह HL60 कोशिकाओं में होने वाली घटनाओं का संकेत के spatiotemporal गतिशीलता: यहाँ, हम करने के लिए विस्तृत विधियों का वर्णन।
Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.
कोशिकाओं भावना और एक chemoattractant ढाल के भीतर उच्च एकाग्रता की ओर ले जाते हैं, एक सेलुलर प्रक्रिया chemotaxis के रूप में भेजा। Chemotaxis निभाता ऐसे embryogenesis 1, न्यूरॉन patterning 2, कैंसर की कोशिकाओं को 3 की मेटास्टेसिस, सूजन 4 की साइटों के लिए न्यूट्रोफिल की भर्ती, और मॉडल जीव Dictyostelium discoideum 5 के विकास के रूप में कई शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका। सामान्य में, कोशिकाओं जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स 5 का उपयोग कर chemoattractants भावना। इन रिसेप्टर्स के साथ chemoattractants की सगाई heterotrimeric जी प्रोटीन Gα और Gβγ, जो बारी में नीचे की ओर संकेत पारगमन मार्ग है कि अंततः actin cytoskeleton के spatiotemporal संगठन सेल प्रवास 5-9 ड्राइव करने के लिए विनियमित सक्रिय की हदबंदी को बढ़ावा देता है।
सेल जीव विकसित किया गया है और chemotax में सुधारassays जांच करने के लिए कैसे जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) संकेत मध्यस्थता सेल प्रवास का निर्देश दिया है। Boyden कक्ष या transwell प्रवास परख Boyden 10 द्वारा 1960 में विकसित किया गया था। परख दो कुओं कि एक microporous झिल्ली से अलग हो रहे हैं के बीच chemoattractant यौगिकों की एक ढाल बनाने के द्वारा काम करता है। अपनी सादगी और उपयोग में आसानी यह सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल करने की तारीख chemotaxis परख करते हैं। हालांकि, परख कोशिकाओं के पलायन की प्रक्रिया सक्षम नहीं है कल्पना की जा सके। Zigmond चैम्बर पहला दृश्य microfluidic युक्ति एक स्रोत chemoattractant 11 की ओर एक संकीर्ण कसना भर में एक coverslip पर सेल प्रवास के स्पष्ट इमेजिंग की अनुमति देता है। डन 12 और 13 insall संशोधित और उच्च संकल्प और Zigmond चैम्बर chemotaxis परख के दीर्घकालिक इमेजिंग क्षमता में सुधार हुआ। क्योंकि द्रव का प्रवाह की अत्यधिक उम्मीद के मुताबिक, प्रसार प्रमुख विशेषताओं में से, microfluidics अगली Generati के लिए समाधान प्रदान किया गया हैऐसे ईज़ी TAXIScan (एक सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस) के रूप में chemotaxis assays पर।
ढाल सुनिश्चित किया की स्थिरता के साथ, उपकरण छह chemotaxis assays एक साथ (चित्रा 1 ए) से बाहर ले जाने के लिए अनुमति देता है। ऊपर विभिन्न चैम्बर assays में उत्पन्न directionally तय ढ़ाल के विपरीत, गींतर Gerisch द्वारा विकसित की सुई या micropipette परख एक जंगम स्रोत 14 के साथ एक ढाल उत्पन्न करता है। परख में, chemoattractant एक स्थिर ढाल उत्पन्न करने के लिए एक जंगम micropipette से जारी है। इस सुई परख के साथ, शोधकर्ताओं ने पाया कि विभिन्न कोशिकाओं मौलिक रूप से अलग विशेषताओं के साथ pseudopods उत्पन्न करते हैं। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी लागू है, हम 15 भर में अपने मात्रात्मक माप की सुविधा के लिए ढाल कल्पना करने में सक्षम थे। इस अध्ययन में, हम एक साथ कई chemotaxis Assa की निगरानी कीमोटैक्टिक HL60 (मानव प्रोमाईलोसाईटिक ल्यूकेमिया) कोशिकाओं, तैयार करने के लिए विस्तृत विधियों का वर्णनसेल गतिशीलता विश्लेषण उपकरण है, और दृश्य, spatiotemporally चलाया chemoattractant उत्तेजनाओं के जवाब में इस तरह के एक जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन काइनेज डी 1 के रूप में संकेतन अणुओं की GPCR मध्यस्थता spatiotemporal गतिशीलता visualizing के साथ वाई एस। हमारे उन्नत इमेजिंग तरीकों सामान्य chemotaxis के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, और स्तनधारी सेल प्रणाली के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं।
वर्तमान अध्ययन में, हम chemotaxis assays के दो उदाहरणों से पता चलता है: पहला, सेल गतिशीलता विश्लेषण उपकरण के द्वारा कई chemotaxis assays के एक साथ निगरानी; और दूसरा, chemoattractant ढाल के दृश्य और वास्तविक समय में एक ही कोशिकाओं में होने वाली घटनाओं का संकेत के spatiotemporal गतिशीलता।
एक साथ कई chemotaxis assays के लिए सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस
वर्तमान अध्ययन में, हम एक सेल गतिशीलता विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर एक साथ कई chemotaxis assays प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की शुरुआत की। इस उपकरण के उपयोगकर्ता पारंपरिक उज्ज्वल क्षेत्र अवलोकन में एक 10x उद्देश्य लेंस के साथ सेलुलर chemotaxis व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है। क्योंकि द्रव का प्रवाह का प्रसार प्रमुख विशेषताओं में से, सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस अत्यधिक उम्मीद के मुताबिक, स्थिर ढ़ाल उत्पन्न करता है और एक साथ बाहर ले जाने के लिए छह chemotaxis assays अप करने के लिए अनुमति देता है। प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम उठाए हैंविश्वसनीय ढ़ाल प्राप्त करने के लिए और छत लाइन पर कोशिकाओं के लिए पंक्ति में। उपयोगकर्ता सख्ती धारक विधानसभा और chemoattractants और कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करना चाहिए। विस्तृत निर्देश भी ऑनलाइन उपलब्ध हैं। वैकल्पिक तरीकों chemotaxis 11-13,15 की तुलना में, इस डिवाइस काफी विश्वसनीयता और chemotaxis assays की दक्षता में सुधार। के आकार में सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस चिप के चार आकार 4, 5, 6, और 8 माइक्रोन विभिन्न प्रकार और कोशिकाओं के आकार को समायोजित करने के लिए उपलब्ध हैं। हमने पाया है कि एक 4 या 5 माइक्रोन सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस चिप HL60 और डी के लिए उपयुक्त है discoideum कोशिकाओं है, जो के बारे में 10-15 मीटर व्यास में हैं। हालांकि, एक सीमा है कि इस डिवाइस कोशिकाओं के सभी प्रकार के लिए उपयुक्त नहीं है। हम छोटी सफलता Raw267.4 कोशिकाओं के साथ सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस chemotaxis परख का उपयोग किया था। कारण यह हो सकता है कि Raw267.4 कोशिकाओं को भी धीरे-धीरे पलायन। समय कुशल चे के लिए आवश्यकRaw267.4 कोशिकाओं के motaxis समय एक ढाल डिवाइस द्वारा बनाए रखा है की तुलना में बहुत लंबे समय तक हो सकता है। इसके बजाय, एक transwell प्रवास परख Raw267.4 कोशिकाओं 9 के लिए अच्छी तरह से काम किया। एक और सीमा फ्लोरोसेंट अवलोकन वर्तमान डिवाइस के साथ संभव नहीं है। एक भविष्य की दिशा उच्च बढ़ाई साथ फ्लोरोसेंट इमेजिंग की निगरानी है। इस सुधार सेल गतिशीलता विश्लेषण उपकरण है, जो फ्लोरोसेंट का पता लगाने और एक 100X उद्देश्य लेंस के साथ सुसज्जित है के साथ संभव है। इसके अलावा, एक साथ assays की संख्या भी 12 की वृद्धि हुई है इन सभी में सुधार chemotaxis assays का बढ़ाया throughput और कोशिकाओं पलायन में subcellular गतिशीलता के अवलोकन की सुविधा।
HL60 कोशिकाओं की उच्च अभिकर्मक दक्षता फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग प्रोटीन व्यक्त करने के लिए
HL60 कोशिकाओं एक सक्रिय रूप से विभाजित ल्यूकेमिया सेल लाइन कर रहे हैं और निलंबन में हो जाना। जैसा कि पहले 18-20 सूचना दी, HL60 कोशिकाओं जी के लिए प्रतिरोधी रहे हैंएकदा हस्तांतरण। दोनों लिपिड और electroporation जीन स्थानांतरण परीक्षण किया गया है, और विस्तार के रूप में वर्णित धारा 4 में उच्च व्यवहार्यता electroporation के बाद गंभीर क्षति है कि electroporation से परिणाम की वजह से उच्च अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है प्राप्त उच्च अभिकर्मक दक्षता, electroporation के साथ प्राप्त किया गया था। बाद में, पूरी तरह से और कोमल सेल से निपटने के लिए आवश्यक हैं, विशेष रूप से electroporation के बाद। सभी मीडिया पूर्व गर्म और धीरे electroporation के बाद किसी भी कदम में कोशिकाओं को जोड़ा रहना होगा। यह भी electroporation अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं के जोखिम के समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। कोशिका मृत्यु से बचने के लिए, electroporation के बाद, 1640 RPMI electroporation वसूली मध्यम कोशिकाओं को तुरंत जोड़ा जाना चाहिए। हमने पाया वसूली माध्यम में 20% FBS 10% FBS तुलना में बहुत अधिक सेल वसूली दर देता है। electroporation के बाद, 30 मिनट के लिए 1640 RPMI electroporation वसूली माध्यम में ऊष्मायन अधिक से अधिक व्यवहार्यता और अभिकर्मक के लिए महत्वपूर्ण हैदक्षता। आगे अभिकर्मक दक्षता बढ़ाने के लिए, हम भी अभिकर्मक प्रति 4 माइक्रोग्राम प्लास्मिड डीएनए है, जो लगभग प्लाज्मिड की दो बार राशि निर्माता से सिफारिश की है इस्तेमाल किया।
प्रोटीन अभिव्यक्ति की भंगुरता और सेल नंबर सीमा (अभिकर्मक प्रति 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं): वहाँ electroporation अभिकर्मक पर दो प्रमुख सीमाएं हैं। अविभाजित कोशिकाओं में, अभिव्यक्ति detectable केवल कोशिका विभाजन की पहली जोड़ी के दौरान, जब से वेक्टर प्लाज्मिड प्रत्येक कोशिका विभाजन के बाद आधे से पतला होता है। भेदभाव HL60 के लिए कोशिकाओं को कोई अधिक से अधिक 48 घंटे के जीवित रहते हैं। नतीजतन, किसी भी प्रयोग ताजा transfections 6 घंटा प्रयोग करने से पहले की आवश्यकता है। एक electroporation के लिए सेल नंबर महज किसी भी जैव रासायनिक assays के लिए न्यूनतम आवश्यकता को पूरा करती है। दोहराव का उपयोग करें या बड़ी मात्रा के प्रयोजन के लिए, यह पुरजोर सिफारिश की है एक undifferentiated HL60 सेल लाइन स्थापित किया है कि कि स्थिरतापूर्वक ब्याज whi के प्रोटीन को व्यक्त करता हैसीएच, एक वायरल वेक्टर द्वारा एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग कर दिया गया है, तो एक वायरल वेक्टर उपलब्ध है या निर्माण किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.
RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
1M HEPES sterile solution, pH7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
2 % Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
Cover glass thickness 2 22 x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
1701RN 10ul syringe | Hamilton | 80030 | |
Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
DIAS software | Solltech Inc. | ||
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |