सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन explant संस्कृति और इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी पर मल्टी इलेक्ट्रोड सरणियों

Summary

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Abstract

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons.

We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

Introduction

In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve ¹.

With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers ^2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device ⁴.

To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) ⁵. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.

Protocol

जानवरों की देखभाल और प्रयोग स्विस स्थानीय अधिकारियों (राशि फर Landwirtschaft und प्रकृति des Kantons बर्न, स्विट्जरलैंड) के दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था। 1. प्रयोगों के लिए समाधान तैयार बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कोटिंग समाधान तैयार (देखें सामग्री तालिका, बिंदु 6): बर्फ पर पिघलना ईसीएम मिश्रण। बुनियादी संस्कृति के माध्यम में ईसीएम मिश्रण 01:10 (neurotrophic कारकों या भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के बिना) पतला और बर्फ पर दुकान। संस्कृति के माध्यम से (देखें सामग्री तालिका, बिंदु 1) तैयार: FBS या मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF) युक्त नहीं Neurobasal माध्यम के एक शेयर की तैयारी। ताजा FBS (10%) और BDNF (5 एनजी / एमएल) सिर्फ सेल संस्कृति को जोड़ने से पहले साथ Neurobasal मीडिया अनुपूरक। कोशिकी समाधान (देखें सामग्री तालिका, बिंदु 2) तैयार करें। 2. धुलाई और Meas का बंध्याकरण <p cलड़की = "jove_content"> नोट: प्रयोगों के लिए इस्तेमाल Meas 68 इलेक्ट्रोड एक आयताकार ग्रिड (चित्रा 1E) में व्यवस्थित होते हैं। प्रत्येक इलेक्ट्रोड केंद्र के लिए केंद्र से 200 मीटर की दूरी के साथ 40 x 40 माइक्रोन 2 का एक आकार है। इलेक्ट्रोड प्लैटिनम के बने होते हैं। इलेक्ट्रोड इंडियम टिन ऑक्साइड का बना एक सर्किट से इसी संपर्कों से जुड़े हैं। इस सर्किट SU-8 के एक 5 माइक्रोन परत से अछूता रहता है। प्रदाता पर जानकारी के लिए सामग्री तालिका देखें। अन्य विदेश मंत्रालय लेआउट इन प्रयोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है। नई Meas के लिए: उन्हें 30 सेकंड के लिए 70% इथेनॉल में डुबो कर कुल्ला और 30 सेकंड के लिए आसुत जल से धो लें। एक लामिना का प्रवाह हुड में काम करते हैं। एक लामिना का प्रवाह हुड में 30 मिनट के लिए विदेश मंत्रालय सूखी। एक व्यक्ति बाँझ पेट्री डिश (35 मिमी x 10 मिमी) में प्रत्येक विदेश मंत्रालय रखो और पन्नी के साथ सील। Meas तक इस्तेमाल किया संग्रहित किया जा सकता है। खेतों में Meas के लिए: एक पेट्री डिश (35 मिमी x 10 मिमी) एंजाइमी solut के 1 मिलीलीटर युक्त Meas सेतेआयन आरटी पर (देखें सामग्री तालिका, बिंदु 6) हे / एन कक्षीय प्रकार के बरतन पर जैविक सामग्री हटा दें। तो 2.1 कदम के रूप में जारी है। ध्यान दें: देखभाल रबर से ढके सुझावों के साथ संदंश का उपयोग के साथ MEAS संभाल लेना। 3. संस्कृति प्रयोगों के लिए Meas की तैयारी सील पन्नी निकालें और पेट्री डिश (35 मिमी x 10 मिमी) पूरे प्रयोग के लिए विदेश मंत्रालय में छोड़ दें। कोट 1.1 में तैयार समाधान के साथ MEAS: प्रत्येक विदेश मंत्रालय के लिए कोटिंग समाधान के 50 μl pipet करने के लिए पूरे क्षेत्र को कवर इलेक्ट्रोड एक ठंडी 200 μl विंदुक टिप (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) का प्रयोग करें। आरटी पर 30 मिनट के लिए 1 घंटे के लिए कोट करने के लिए Meas की अनुमति दें। कोटिंग समाधान के लिए एक पिपेट का उपयोग निकालें। 10% FBS और 5ng / एमएल BDNF के साथ पूरक संस्कृति के माध्यम से 100 μl लागू करें और ऊतक चढ़ाना जब तक आरटी पर छोड़ दें। 2 पेट्री एक बड़े पेट्री डिश (94 मिमी x 16 मिमी) में लेपित Meas युक्त बर्तन रखें और 1.5 युक्त एक तिहाई छोटे पेट्री डिश जोड़नेआर्द्रीकरण के लिए फॉस्फेट खारा बफर के मिलीलीटर (पीबीएस)। नोट: एक छोटा सा पेट्री डिश (3.5 चरण) पीबीएस युक्त जोड़ना काफी संस्कृति के माध्यम से वाष्पीकरण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। 4. सर्पिल नाड़ीग्रन्थि विच्छेदन नोट: सकल विच्छेदन लामिना का प्रवाह हुड के बाहर किया जा सकता है (4.4 करने के लिए 4.1 चरण)। ठीक विच्छेदन बाँझ शर्तों (लामिना का प्रवाह हुड) के लिए (4.5 कदम से) अनिवार्य हैं। प्रायर संज्ञाहरण के बिना कत्ल द्वारा जानवरों (5-7 दिन पुराने चूहों) euthanize। 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा सिर जीवाणुरहित। सिर धारण करके, त्वचा और बाण रेखा के साथ एक तेज / तेज कैंची के साथ खोपड़ी के बीच कनेक्शन काट दिया। खोपड़ी sagittally कट और तेज / कुंद कैंची का उपयोग मस्तिष्क को हटा दें। खोपड़ी से लौकिक हड्डियों कट और बाँझ बर्फ के ठंडे हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HBSS) युक्त एक पेट्री डिश में उन लोगों के लिए जगह है। एक dissec का प्रयोगtion माइक्रोस्कोप, ठीक संदंश का उपयोग मध्य कर्ण बुल्ला काटना और भीतरी कान अलग। कोक्लीअ की हड्डी निकालें, ठीक संदंश का उपयोग। सर्पिल बंधन और हलकी लीक vascularis निकालें (एसवी) एक साथ संदंश के साथ सर्पिल नाड़ीग्रन्थि (एसजी) और एसवी के बेसल भाग पकड़ रहा है और धीरे-धीरे करने वाली सर्वोच्च आधार से एसवी unwinding द्वारा कोर्टी (ओसी) के अंग को अलग, एसजी और modiolus (चित्रा 1 ए – सी) एसजी और modiolus से ओसी अलग संदंश के साथ एसजी और आयोजन समिति के बेसल भाग पकड़ रहा है और धीरे-धीरे आधार करने वाली शीर्ष से ओसी unwinding द्वारा। सर्पिल नाड़ीग्रन्थि से कट पार्श्व explants (200 व्यास में से 500 माइक्रोन) अभी भी modiolus (चित्रा -1) एक संदंश और एक माइक्रो स्केलपेल का उपयोग करने के लिए संलग्न। 5. सर्पिल नाड़ीग्रन्थि Explant Meas पर संस्कृति दो सर्पिल नाड़ीग्रन्थि explants पहले 10 के साथ तैयार विदेश मंत्रालय पर इलेक्ट्रोड के लिए अगले जगहसंस्कृति के माध्यम से 0 μl। Corti के अंग लगभग 5 मिमी इलेक्ट्रोड क्षेत्र से दूर रखें। जबकि ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए विदेश मंत्रालय पर explants और Corti के अंग पिन करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर और संस्कृति में सावधानी रखें Meas और 5% सीओ 2। अगले दिन, नेत्रहीन का निरीक्षण किया है कि explants विदेश मंत्रालय से जुड़ी है। नोट: explants हे / एन संलग्न नहीं किया है, वे शायद ही कभी अगले दिनों में ऐसा करेंगे। ओसी पौष्टिकता / neurotrophic समर्थन के लिए संस्कृति से सटे रखा गया है। लगातार 5 दिनों के लिए 10% FBS और BDNF दैनिक युक्त मध्यम संस्कृति के 100 μl जोड़ें। 6 दिन पर एक अतिरिक्त 13 दिनों के लिए FBS और 5ng / एमएल BDNF और संस्कृति ऊतक युक्त 10% संस्कृति के माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 6. electrophysiological रिकॉर्डिंग सहज और इलेक्ट्रोड उत्तेजना निर्भर गतिविधि की जांच करने के लिए बाह्य के साथ विदेश मंत्रालय संस्कृति धो इसलिएlution 1.3 चरण में तैयार, आरटी पर। एक ऊतक के साथ संपर्क सूखी और विदेश मंत्रालय स्थापना पर विदेश मंत्रालय माउंट। नोट: बढ़ते दौरान संस्कृति नम रखने के लिए, संस्कृति के लिए बाह्य समाधान की एक छोटी सी बूंद जोड़ें। कोशिकी समाधान के 300 μl जोड़ें और रिकॉर्डिंग से पहले 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, प्रणाली को स्थिर करने की अनुमति है। रिकॉर्ड पर दबाने से सभी इलेक्ट्रोड से 2 मिनट के लिए रिकॉर्ड सहज गतिविधि / अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का बटन और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की पहचान। विदेश मंत्रालय इलेक्ट्रोड उत्तेजना: उपयुक्त सॉफ्टवेयर पर प्रोत्साहन के आयाम / अवधि / आकार का चयन करें और लगातार रूप में वर्णित 13 कई इलेक्ट्रोड के लिए लागू होते हैं। (कदम 6.4 के रूप में) सहज गतिविधि दिखा लोगों पर आधारित इलेक्ट्रोड का चयन करें। शेष इलेक्ट्रोड के सभी रिकार्ड से। उत्तेजना विरूपण साक्ष्य को बाहर करने के लिए, एक ही इलेक्ट्रोड से 10 बार उत्तेजित। संस्कृति से प्रतिक्रिया करता है, तो कम से कम 8 से 10 गुना से बाहर है, यह एक के रूप में माना जा सकता हैइलेक्ट्रोड प्रेरित उत्तेजना पर सकारात्मक प्रतिक्रिया। पृष्ठभूमि शोर की पहचान करने के लिए, tetrodotoxin (TTX) cultureat के लिए एक एकाग्रता 1 माइक्रोन से लागू होते हैं, 2 मिनट के लिए वोल्टेज gated सोडियम चैनल और रिकॉर्ड ब्लॉक करने के लिए। इस का प्रयोग करें कील का पता लगाने (7.1 और 7.2) प्रदर्शन करने के लिए। 7. डेटा विश्लेषण नोट: डेटा विश्लेषण पहले 6 और 5 में विस्तार से वर्णन किया गया है। सॉफ्टवेयर पर विशेष इस अध्ययन में इस्तेमाल के लिए देखें सामग्री तालिका, बिंदु 7। उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक इलेक्ट्रोड मानक विचलन और बाद में एक discriminator के आधार पर एक डिटेक्टर को रोजगार के लिए सहज गतिविधि का पता लगाने। यह प्रक्रिया 6 में वर्णित है। गतिविधि के रूप में तेजी से वोल्टेज यात्रियों (<5 मिसे) प्रकट होता है। एक सीमा है कि कोई भी गतिविधि में परिणाम है जब TTX एक प्रयोग के लिए samples.Adapt सीमा मूल्य में इलाज का विश्लेषण झूठी Positiv के बीच भेदभाव करने के लिए चुनेंई और नकारात्मक झूठी पता लगाने। का उपयोग करना उचित सॉफ्टवेयर मानक प्रक्रियाओं (- सी चित्रा 2A देखें) के अनुसार एक रेखापुंज साजिश के रूप में प्रत्येक इलेक्ट्रोड का पता लगाया neuronal गतिविधि निरीक्षण करते हैं। निर्धारित और 10 मिसे की एक रपट खिड़की के भीतर सभी का पता चला घटनाओं, 1 मिसे कदम से स्थानांतरित कर दिया संक्षेप द्वारा कुल नेटवर्क गतिविधि प्रदर्शित करते हैं। उचित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कच्चे डेटा प्रदर्शित करके उत्तेजना प्रेरित गतिविधि का पता लगाने। ऑफ़लाइन मैन्युअल एकल spikes को पहचानें। एकल spikes के रूप में तेजी से वोल्टेज यात्रियों दिखाई देते हैं, उत्तेजना विरूपण साक्ष्य (चित्रा 2 ई में तीर सिर) के बाद होने वाली। एक उदाहरण चित्रा 2 ई में दिखाया गया है। प्रयोग के आधार पर, जवाब इलेक्ट्रोड की संख्या, सीमा एक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए की जरूरत है, इलेक्ट्रोड और ब्याज 5 के अन्य मानकों के अनुसार कार्य क्षमता की संख्या का विश्लेषण। 8. ऊतक निर्धारण और Immunohistochemistry ध्यान दें: धुंधला प्रक्रिया विदेश मंत्रालय को नष्ट कर देगा। अभिकर्मकों के लिए सामग्री तालिका (4 अंक) देखें। सीधे रिकॉर्डिंग के बाद 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पीबीएस तीन बार के साथ संस्कृतियों धो लें। पीबीएस त्यागें और 4% paraformaldehyde (पीएफए) (पीबीएस में), 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए छोड़ देते लागू होते हैं। चेतावनी: पीएफए ​​विषैला होता है। उचित संरक्षण और त्यागने समाधान के दिशा-निर्देशों के अनुसार के साथ एक रासायनिक हुड में काम करते हैं। संस्कृतियों पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और 2 घंटे के लिए पीबीएस में 2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) (0.01% ट्राइटन-X100) के साथ ब्लॉक। पहले एंटीबॉडी (विरोधी βIII ट्यूबिलिन, Tuj एंटीबॉडी) पीबीएस (2% BSA और 0.01% ट्राइटन-X100) में पतला जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ हे / एन। संस्कृति पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। नोट: पर अब से नमूना अंधेरे में जितनी बार संभव माध्यमिक fluorescently लेबल एंटीबॉडी के विरंजन को कम से कम रखने के लिए। माध्यमिक एंटीबॉडी, पीबीएस में पतला जोड़ना (2% बीएसए एकडी 0.01% ट्राइटन-X100) और आरटी पर 1 से 2 घंटे के लिए सेते हैं। 10 मिनट के लिए 10,000 DAPI (1 मिलीग्राम / एमएल शेयर): दाग नाभिक 1 जोड़ें। पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और पतली कवर फिसल जाता है के लिए पीछे की ओर नमूने माउंट (24 x 50 मिमी 2) बढ़ते मध्यम (देखें सामग्री तालिका, 4 अंक) का उपयोग कर। छवि 5X और 20x बढ़ाई के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग।

Representative Results

चित्रा 1 ऊतक अलगाव, तैयारी और विदेश मंत्रालय पर संस्कृति के लिए प्रक्रिया का सार। हम कोर्टी (ओसी) और हलकी लीक vascularis (एसवी) के अंग का संवेदी उपकला से सर्पिल नाड़ीग्रन्थि (एसजी) को अलग-थलग करने के लिए ऊतक विच्छेदन की लगातार कदम दिखाने के लिए और कब्जा कर लिया सर्पिल बंधन (चित्रा 1 ए – सी)। सर्पिल नाड़ीग्रन्थि explants (संख्या में 3-4) नाड़ीग्रन्थि से सूक्ष्म कैंची से काट रहे हैं के रूप रेखाचित्र के रूप में चित्रा -1 में सचित्र और विदेश मंत्रालय (चित्रा 1E) पर रखा इलेक्ट्रोड क्षेत्र पर कब्जा कर (2.2 मिमी 2) से अधिक है। ओसी निकटता में रखा गया है, इलेक्ट्रोड सतह के बाहर। संस्कृति के विकास के समय (चित्रा 1G) पर नजर रखी जा सकती है। प्रोटोकॉल के एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1F में दिखाया गया है। Electrophysiological गतिविधि संस्कृति के 6 दिन है, जो लंबे समय तक संस्कृति समय के साथ वृद्धि के बाद पता लगाया जा सकता है। हम recommend 18 दिन संस्कृतियों जो पहले के समय अंक 5 की तुलना में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की काफी अधिक संख्या उत्पादन का आकलन। चित्रा 1. सेल संस्कृति तैयारी। (ए) हौसले माउस भीतरी कान विच्छेदित। व्हाइट धराशायी लाइन इंगित करता है कोक्लीअ के स्थान, काले धराशायी लाइन vestibular क्षेत्र इंगित करता है। कर्णावत बोनी दीवार को हटाने के बाद (बी) माउस भीतरी कान। कर्णावत बदल जाता है सफेद धराशायी लाइनों द्वारा संकेत कर रहे हैं। (सी) सर्पिल नाड़ीग्रन्थि (एसजी) और modiolus, कोर्टी (ओसी) और हलकी लीक vascularis (एसवी) और सर्पिल बंधन के अंग विच्छेदन के बाद दिखाए जाते हैं। (डी) एसजी और ओसी विच्छेदन और एसजी explant तैयारी {आंकड़ा प्रकाशक से अनुमोदन के साथ 5 से अनुकूलित} के योजनाबद्ध। (ई) इस अध्ययन में इस्तेमाल बहु इलेक्ट्रोड सरणी का चित्रण। recodingइलेक्ट्रोड केंद्र में एक आयताकार ग्रिड में संगठित और 2.2 मिमी 2 के एक क्षेत्र पर कब्जा कर रहे हैं। 4 ग्राउंड इलेक्ट्रोड और पक्ष संपर्क सचित्र हैं। (एफ) संस्कृति प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध। रिकॉर्डिंग दिन 18. (जी) प्रतिनिधि चित्र (उज्ज्वल क्षेत्र छवियों) और दिन 1, 6 और 18 के स्केल सलाखों = 400 माइक्रोन पर संस्कृति में निगरानी विदेश मंत्रालय पर एसजी explants की योजनाओं पर प्रदर्शन कर रहे हैं। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा। सहज गतिविधि विदेश मंत्रालय पर पता चला और एक रेखापुंज साजिश जहां साजिश की हर पंक्ति में पता चला कील का प्रतिनिधित्व के रूप में दिखाया जा सकता है। एक प्रतिनिधि (रेखांकन में अलग अलग रंग) कई इलेक्ट्रोड से पता चला सहज गतिविधि दिखा उदाहरण दिखाया गया है (चित्रा 2A, 2 बी, और 2 सी)। <p class="jove_content" fo:keep-together.within-पेज = "1"> इसके अतिरिक्त, विदेश मंत्रालय इलेक्ट्रोड संस्कृति को प्रोत्साहित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक biphasic उत्तेजना के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्रा 2 डी) नाड़ी दिखा एक प्रतिनिधि उदाहरण, 5 जवाब इलेक्ट्रोड (लाल निशान) और गैर-जवाब इलेक्ट्रोड (नीले निशान) चित्रा 2 ई में दिखाया गया है। इन प्रयोगों के लिए एक इलेक्ट्रोड उत्तेजना और रिकॉर्डिंग के लिए अन्य सभी इलेक्ट्रोड के लिए इस्तेमाल किया गया था। एकल कार्रवाई क्षमता उत्तेजना विरूपण साक्ष्य (काला तीर सिर) के बाद 1 मिसे दिखाई दिया। विदेश मंत्रालय के आदेश इलेक्ट्रोड क्षेत्र में neuronal प्रक्रियाओं के कवरेज का आकलन करने में प्रक्रिया के अंत में immunostained जा सकता है। इलेक्ट्रोड चित्रा 2 एफ में हरे रंग में संकेत उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया गया था, और लाल रंग में संकेत दिया इलेक्ट्रोड प्रतिक्रियाओं (चित्रा 2 ई) दर्ज करने के लिए इस्तेमाल किया गया। चित्रा 2. विदेश मंत्रालय पर डेटा रिकॉर्डिंग। (ए </ Strong>) 63 में से छह सहज गतिविधि दिखा इलेक्ट्रोड के मूल रिकॉर्डिंग के निशान। कील पता लगाने के बाद चित्रा 2A के छह इलेक्ट्रोड का (बी) रेखापुंज साजिश है। प्रत्येक बार एक संभावित कार्रवाई का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) सभी इलेक्ट्रोड गतिविधि (ए और बी) के रूप में शामिल है रेखापुंज साजिश 2 मिनट के लिए 63 इलेक्ट्रोड (चैनलों की संख्या 0-63) से दर्ज की गई है। (डी) 80 μsec की कुल अवधि और 80 μA के आयाम के साथ एक Biphasic प्रोत्साहन एक इलेक्ट्रोड (चित्रा 2 एफ में E58) से संस्कृति की उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया गया था। (ई) इलेक्ट्रोड 58 कार्रवाई की क्षमता (लाल निशान) दिखाने से उत्तेजना के बाद प्राप्त कच्चे डेटा निशान के प्रतिनिधि उदाहरण या प्रतिक्रियाएं (नीले निशान) उत्तेजना के बाद बिना (काला तीर-सिर)। (एफ) neuronal मार्कर Tuj (हरा) के लिए immunostained विदेश मंत्रालय पर सर्पिल नाड़ीग्रन्थि संस्कृति प्रयोग न्यूरो कल्पना करने के अंत में इलेक्ट्रोड क्षेत्र के एनएएल कवरेज {आंकड़ा प्रकाशक से अनुमोदन के साथ 5 से अनुकूलित}। इलेक्ट्रोड 58 उत्तेजना के लिए इस्तेमाल हरे रंग में संकेत दिया है, जवाब इलेक्ट्रोड लाल रंग में संकेत कर रहे हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। अंत में, विदेश मंत्रालय सेटअप संभव इलेक्ट्रोड सतह संशोधन कि रिकॉर्डिंग संवेदनशीलता में वृद्धि हो सकती अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। , ग्रे प्लेटिनम (ग्रे पं) एक 150 एनएम मोटी पं परत (मुक़ाबला: 400 KΩ / 1 kHz) से मिलकर: दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विदेश मंत्रालय इलेक्ट्रोड दो अलग प्लैटिनम सतहों के साथ इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया और काले प्लेटिनम, (काला, पं), माइक्रो-निर्माण की प्रक्रिया (: 20 KΩ / 1 KHz प्रतिबाधा) के अंत में पंडित के विद्युत बयान से प्राप्त की। जानकारी के लिए सामग्री तालिका (बिंदु 6) देखें। ईएनटी "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> छह स्वतंत्र विदेश मंत्रालय के प्रयोगों इलेक्ट्रोड प्रकार प्रति प्रदर्शन किया गया काला पंडित विदेश मंत्रालय विदेश मंत्रालय (चित्रा 3 ए) के अनुसार इलेक्ट्रोड के एक उच्च संख्या पर neuronal गतिविधि का पता लगाने के लिए अनुमति देता है और की कमी। प्रोत्साहन आयाम एक प्रतिक्रिया (चित्रा 3 बी) प्रकाश में लाना करने की जरूरत है। हम 30-35 स्वतंत्र इलेक्ट्रोड जोड़े के लिए विश्लेषण, 6 अलग प्रयोगों में, वर्तमान सीमा एक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए की जरूरत है। काले पं इलेक्ट्रोड प्रदर्शन काफी बेहतर 31.09 μ ए की एक सीमा दिखा +/- 2.4 ग्रे पं इलेक्ट्रोड 47.57 μ एक +/- 1.97 की तुलना में। 3. ग्रे के बनाम काले पं इलेक्ट्रोड तुलना चित्रा। (ग्रे और ब्लैक पं) इलेक्ट्रोड के दो प्रकार के 12 स्वतंत्र विदेश मंत्रालय संस्कृतियों, प्रत्येक विदेश मंत्रालय के प्रकार पर 6 का उपयोग कर कंधे से कंधा मिलाकर तुलना की गई। (ए) पुन की कुल संख्याप्रयोग के प्रति sponding इलेक्ट्रोड दिखाया गया है। (बी) के एक प्रतिक्रिया बटोर आयाम सीमा 6 स्वतंत्र विदेश मंत्रालय के प्रयोगों में 30-35 स्वतंत्र जोड़े इलेक्ट्रोड का उपयोग करके मापा दिखाया गया है। डेटा के रूप में मतलब +/- एसडी दिखाए जाते हैं। (छात्र टी परीक्षण पी <0.001) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल यहाँ बताया कि कैसे विदेश मंत्रालय पर संस्कृति एसजीएन explants करने और बाह्य गैर इनवेसिव रिकॉर्डिंग द्वारा एसजीएन गतिविधि का आकलन से पता चलता है। इस मंच और प्रोटोकॉल हम हाल ही में विकसित किया है ⁵ एसजीएन सक्रिय करने के लिए, कर्णावत प्रत्यारोपण और अन्य न्यूरो कृत्रिम अंग के आगे कार्यान्वयन के लिए संभावित दिलचस्पी के साथ उपन्यास उत्तेजना प्रोटोकॉल और इलेक्ट्रोड सामग्री कम ऊर्जा आवश्यकताओं में जिसके परिणामस्वरूप की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। प्रस्तुत की प्रक्रिया में कई सावधानियों सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों की सिद्धि के लिए मौलिक हैं।

सर्पिल नाड़ीग्रन्थि और प्राथमिक ऊतक के आगे से निपटने की सावधानी से विच्छेदन विशेष सावधानी की आवश्यकता है। इन प्रयोगों वर्ष 5 और 7 दिनों के बीच C57 / BL6 चूहों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है। इसी तरह के परिणाम एक ही उम्र सीमा में Wistar चूहों का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे, (डेटा) नहीं दिखाया। हम मानते हैं कि यह ठीक विच्छेदन के लिए सबसे अच्छा उम्र के रूप में है कर्णावत हड्डी अभी भी en नरम हैough संदंश द्वारा आसानी से हटाने, और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि और Corti के अंग के लिए आसानी से डेन्ड्राइट प्रक्रियाओं या एसजीएन somas rupturing बिना अलग किया जा सकता है। पहले उम्र में ऊतक भी नरम है और संभावना है कि एसजीएन चीर करने के लिए एक साथ somas Corti के अंग के साथ अधिक है, जबकि बाद के चरणों में, कोक्लीअ की बोनी कैप्सूल का सख्त ऊतकों को नुकसान पहुँचाए, जबकि विदारक का खतरा बढ़ जाता है। एसजी के समुचित अलगाव के रूप में अच्छी तरह से explants से सावधान काटने के लिए महत्वपूर्ण है। ये रेंज में के आकार में 200-500 माइक्रोन विदेश मंत्रालय की सतह के लिए लगाव को अधिकतम करने और explants, जिसमें से neurites regrow होगा एसजी somas की पर्याप्त संख्या के लिए किया जाना चाहिए। संस्कृति के प्रारंभिक दिनों में neurotrophic समर्थन बढ़ाने के लिए, ताजा BDNF दैनिक जोड़ा जाता है और Corti के अंग सह संस्कृति में रखा गया है।

विच्छेदन की गति भी महत्वपूर्ण है। सभी चरणों का आदेश ऊतक गिरावट को कम करने के लिए तेजी से और बर्फ के ठंडे समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए।इच्छामृत्यु और विदेश मंत्रालय पर explant रखने के बीच समय 10-15 मिनट के बीच होना चाहिए और सफल संस्कृतियों के लिए महत्वपूर्ण है। संस्कृति चढ़ाना में देरी से बचने के लिए सभी उपकरण तैयार है।

ठीक विच्छेदन, संस्कृति के रखरखाव और मध्यम और उपकरणों की तैयारी सहित सभी कदम, बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है। जब ईसीएम समाधान के साथ विदेश मंत्रालय कोटिंग यह बर्फ पर पिघलना करने के लिए और उच्च तापमान पर ठंडा पिपेट सुझावों और ईसीएम मिश्रण जैल के रूप में ठंडा माध्यम का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। जब Meas पर explants रखने, पहले, इलेक्ट्रोड क्षेत्रों के लिए मध्यम जोड़ने बाद में explants जगह है। मध्यम चरण में एक दूसरे से जोड़ा जाता है, तो explants विदेश मंत्रालय से की वजह से तनाव कर्तन को अलग करने के लिए करते हैं। मध्यम की छोटी मात्रा में पहले 5 दिनों में संस्कृति के लिए लागू कर रहे हैं क्योंकि, संस्कृति के माध्यम से वाष्पीकरण कम से कम हो गया है। इसलिए यह अत्यधिक एक humidified कक्ष छोटे पेट्री बंद Proxim में पीबीएस युक्त व्यंजन का उपयोग कर बनाने के लिए सिफारिश की हैMeas को अल्पसंख्यक।

यहाँ वर्णित प्रयोगों विशिष्ट इलेक्ट्रोड आयाम, कोटिंग सामग्री और इंट्रा इलेक्ट्रोड दूरी (2 में वर्णित के रूप में, नोट) के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विदेश मंत्रालय इलेक्ट्रोड का उपयोग प्रदर्शन किया गया। संस्कृति शर्तों के क्रम में विशिष्ट इलेक्ट्रोड ग्रिड डिजाइन के neuronal कवरेज को अधिकतम करने के लिए यहाँ अनुकूलित किया गया है। ऐसा नहीं है कि इलेक्ट्रोड रिक्ति, geometries और सतहों की अन्य विन्यास विभिन्न कोटिंग्स या सेल घनत्व की आवश्यकता हो सकती संभव है। ये कदम प्रारंभिक समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती आदेश में उच्च घनत्व संस्कृतियों को प्राप्त करने में।

electrophysiological रिकॉर्डिंग के संबंध में, रिकॉर्डिंग संस्कृति आरटी पर कोशिकी समाधान करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के माध्यम से स्थानांतरित कर रहा है शुरू करने से पहले। आदेश अस्थिर रिकॉर्डिंग से बचने के लिए, लगभग 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा संस्कृति को स्थिर करने की अनुमति है। जब संस्कृति उत्तेजक, विशेष रूप से सावधानी प्रोत्साहन के चयन में इस्तेमाल किया जाना चाहिएके रूप में बड़े आयाम (> 3 वी) और durations संस्कृति को नुकसान हो सकता है। उत्तेजना पल्स आकार और अवधि के विषय में एक संदर्भ के लिए संदर्भ ⁵ देखते हैं।

डाटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण घर का बना हार्डवेयर (रिकॉर्डिंग कक्ष, एम्पलीफायरों और एम्पलीफायरों के लिए कनेक्शन) के लिए इस्तेमाल कर रहे थे और विशिष्ट विश्लेषण कार्यक्रमों का चयन किया गया है (देखें सामग्री तालिका, बिंदु 7)। हालांकि, अन्य वाणिज्यिक विदेश मंत्रालय setups और अन्य सॉफ्टवेयर संकुल इन कार्यों के लिए भी अनुकूल हैं। हम पहले 3 अलग अलग समय बिंदुओं पर हमारी संस्कृति की प्रतिक्रियाओं का आकलन किया और लंबे समय तक संस्कृति समय ^{5 के} साथ एक वृद्धि की गतिविधि से पता चला है। यहाँ हम रिकॉर्डिंग के लिए इन विट्रो में 18 दिनों के सुझाव देते हैं। विदेश मंत्रालय बाँझ, humidified कक्षों में सतत रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति प्रणाली, प्रत्येक संस्कृति प्रकार के लिए इष्टतम समय बिंदुओं की पहचान की सुविधा सकता है।

इस bioassay की एक बड़ी खामी टी में उच्च भिन्नता हैवह संस्कृति के अनुसार इलेक्ट्रोड है कि उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं को दिखाने की संख्या। उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं की यह दर मुख्य रूप से चार कारकों पर निर्भर करता है: संस्कृति में neurites का घनत्व, neurites और इलेक्ट्रोड, neurites या neurites बंडलों के व्यास, और इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा के बीच संपर्कों। neurite घनत्व के बारे में, केवल neurites कि कम से कम दो इलेक्ट्रोड के साथ बढ़ती उत्तेजना प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। neurites और इलेक्ट्रोड के बीच संपर्क के आसपास के ऊतक है कि एक हाथ पर, संपर्क खराब हो, या दूसरे हाथ पर, इलेक्ट्रोड से neurites अलग कर सकते हैं, और इस तरह neurites और आसपास के स्नान से इलेक्ट्रोड को अलग-थलग करने और इस प्रकार में सुधार पर निर्भर करता है संपर्क। ऊतक घनत्व, साथ ही neurite आकार, explant का इस्तेमाल किया और संस्कृति की स्थिति से परिभाषित कर रहे हैं। अलग neuronal संस्कृतियों भी सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है, लेकिन इन संस्कृतियों में neuronal घनत्व काफी कम है, सिफारिश की संख्या कम है, जिसके परिणामस्वरूपrding इलेक्ट्रोड। इसलिए सेल संस्कृति विशिष्ट वैज्ञानिक सवाल को संबोधित किया जा करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

अंत में, इलेक्ट्रोड का मुक़ाबला मुख्य रूप से आकार और इलेक्ट्रोड की सतह द्वारा दिया जाता है। सामग्री, इस तरह के काले प्लैटिनम के रूप में एक बड़े सतह बनाने के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है, इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा कम हो भी इलेक्ट्रोड और neurites ^7-9 के बीच युग्मन सुधार हो सकता है।

उत्तेजना की सफलता की दर में सुधार करने के लिए रणनीतियाँ इसलिए संस्कृति की स्थिति के अनुकूलन, कुल इलेक्ट्रोड या इलेक्ट्रोड घनत्व की संख्या में वृद्धि और इलेक्ट्रोड सतह ¹⁰ के मॉडुलन शामिल हैं।

अब, एसजी न्यूरॉन्स की electrophysiological लक्षण वर्णन पैच दबाना तकनीक का उपयोग किया गया था। इस कार्रवाई की क्षमता के intracellular रिकॉर्डिंग और से intracellular आयनिक धाराओं के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता हैएकल न्यूरॉन्स। यहाँ हम इन विट्रो bioassay है कि एक साथ कई न्यूरॉन्स की बाह्य उत्तेजना के लिए सहज गतिविधि या प्रतिक्रिया का विश्लेषण करके सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की गतिविधियों प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उपस्थित थे। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोड और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स के बीच बातचीत का अध्ययन किया और संशोधित या नई सामग्री के आवेदन के द्वारा अनुकूलित किया जा सकता। अंत में, भले ही यहां नहीं दिखाया गया है, इस मंच संयोजन में एक बाहरी इलेक्ट्रोड के साथ प्रयोग किया जा सकता है, एक micromanipulator पर घुड़सवार के रूप में हाल ही में हमारे समूह ⁵ से दिखाया गया है, उत्तेजक इलेक्ट्रोड और संस्कृति गतिविधि की दूरी के बीच संबंध का अध्ययन करने के क्रम में। इन सभी पहलुओं के लिए उपन्यास कर्णावत प्रत्यारोपण इलेक्ट्रोड की प्रमुख विशेषताओं में से नकल उतार उपन्यास कृत्रिम उपकरणों के डिजाइन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं अनुमति देते हैं।

हमारे मॉडल एक बहुत ही श्रवण न्यूरॉन्स और आगे सेशन की उत्तेजना की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए रणनीति की जांच करने के लिए इन विट्रो उपकरण में उपयोगी हैtimize सीआई प्रौद्योगिकी। एक बार जब तकनीक में महारत हासिल है, एक चर के एक नंबर के संशोधन के लिए स्क्रीनिंग की कल्पना कर सकता है: एक) विभिन्न neuronal आबादी, ख) अलग इलेक्ट्रोड सामग्री / आकार / impedances ग) पुरानी प्रयोगों प्रदर्शन सामग्री विषाक्तता या इलेक्ट्रोड उत्तेजना प्रेरित विषाक्तता परीक्षण करने के लिए है, जो इन विवो इलेक्ट्रोड सरणियों द्वारा सुरक्षित और अधिक प्रभावी उत्तेजना प्रोटोकॉल पर प्रकाश डाला सकता है।

Materials

culture medium
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049	24 ml (for 25 ml)
HEPES	Invitrogen	15630-080	250 μl (for 25 ml)
Glutamax	Invitrogen	35050-061	250 μl (for 25 ml)
B27	Invitrogen	17504-044	500 μl (for 25 ml)
FBS	GIBCO	10099-141	10% (for 25 ml)
BDNF	R&D Systems	248-BD-025/CF	final 5 ng/ml (for 25 ml)
Name	Company	Catalog Number	Comments
extracellular solution (pH 7.4)
NaCl			145mM
KCl			4mM
MgCl2			1mM
CaCl2			2mM
HEPES			5mM
Na-pyruvate			2mM
Glucose			5mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
blocking solution
PBS	Invitrogen	10010023
BSA	Sigma	A4503-50G	2%
Triton X-100	Sigma	X100	0.01%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
TuJ	R&D Systems	MAB1195	dil 1:200
DAPI	Sigma	D9542
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Fluoreshild	Sigma	F6057
Name	Company	Catalog Number	Comments
plastic/tools
petri dish 35 mm	Huberlab	7.627 102
petri dish 94 mm	Huberlab	7.633 180
Dumont #5 tweezer	WPI	14098
Dumont #55 tweezer	WPI	14099
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Enzymatic solution: Terg-a-Zyme	Sigma	Z273287-11KG
Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM	Corning	356230
MEA electrodes	Qwane Biosciences		(Lausanne, Switzerland)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Labview	National Instruments		Switzerland
IgorPro	WaveMetrics		Lake Oswega, USA