Die Adsorption von Peptiden an Kunststoffwaren während herkömmlicher spitzenbasierter serieller Verdünnungen kann die Wirksamkeitsbestimmung erheblich beeinflussen und das Verständnis der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen verwirren, die für die Leitstrukturidentifizierung und Leitstrukturoptimierungsphasen der Wirkstoffforschung verwendet werden. Hier werden Verfahren zur automatisierten akustischen berührungslosen seriellen Verdünnung von Peptidproben beschrieben.
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Methodenartikel
Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wie bei Entdeckung kleines Molekül als Wirkstoff, erfordert das Screening für Peptid-Agonisten die serielle Verdünnung von Peptiden Konzentrations-Wirkungs-Kurven zu erzeugen. Screening Peptide bietet eine zusätzliche Ebene der Komplexität als herkömmliche Spitzenbasis Probenhandhabungsverfahren Peptide zu einer großen Oberfläche von Plastikmaterialien belichten, eine erhöhte Chance für Peptidverlust durch Adsorption bereitstellt. Verhindern übermäßigen Exposition gegenüber Kunststoffgeschirr reduziert Peptidverlust durch Festhalten an Kunststoffen und minimiert somit Ungenauigkeiten in Potenz Vorhersage, und wir haben zuvor beschrieben die Vorteile von akustischen berührungslosen Abgabe für in vitro High-Throughput - Screening von Peptidagonisten 1. Hier diskutieren wir eine vollständig integrierte Automatisierungslösung zur berührungslosen akustischen Herstellung von Peptid-Reihenverdünnungen in Mikrotiterplatten unter Verwendung der beispielsweise zum Screenen von Peptidagonisten an der Maus Glucagon-like Peptid-1-Rezeptor (GLP-1R). Unsere Methoden ermöglichen hohe-throughput zellbasierten Assays zum Screenen auf Agonisten und sind leicht skalierbar erhöhten Probendurchsatz zu unterstützen, oder für eine erhöhte Anzahl von Kopien Testplatte (beispielsweise für eine Gruppe von mehreren Zielzelllinien) zu ermöglichen.
Einleitung
Die GLP-1R ist ein etabliertes Medikament Ziel bei der Behandlung von Typ - 2 - Diabetes 2. Das native Peptid - Agonisten für diesen Rezeptor, GLP-1, hat eine in vivo Halbwertszeit von 2-3 min 3. Die Bindung von GLP-1 an seinen G-Protein-gekoppelten Rezeptorziel Ergebnisse in der stromabwärtigen Herstellung des second messenger cAMP durch native G-Protein-Kopplung an die Aktivierung von Adenylatcyclase. Die Messung des akkumulierten cAMP stellt eine robuste Test-Rezeptoraktivierung zu überwachen und für die aktive GLP-1-Analoga mit bevorzugten physikalisch-chemischen Eigenschaften zu screenen. Ein solcher Assay erfordert die serielle Ve....
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Protokoll
1. Peptidserienverdünnung
- Bereiten Assaypuffer: Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS), supplementiert mit 25 mM HEPES, 0,1% BSA und 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), pH 7,4.
- Verwenden Sie einen Bulk-Reagenzspender systematisch 5 ul Testpuffer hinzufügen zu jeder Vertiefung von fünf 384-Well-Low-Volume-Testplatten.
- Verwenden Sie den internen Software ein Abgabeprogramm für 5 ul Volumen zusätzlich zu jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte zu erstellen, wie Anweisungen des Herstellers.
- Tauchen Abgabe Kassettenschläuche in Testpuffer und Prime Flüssigkeit.
- Legen Sie 384-well geringem Volumen Assayplatte auf Plattent....
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Ergebnisse
Wir verwenden routinemäßig einen zweistufigen Verfahren Peptide über akustische Übertragung zu verdünnen. Für den ersten Schritt wird ein akustisches Spender mit Automatisierungs fluchtet verwendet vier Stammpeptidzwischenverdünnungen über zwei Quellenplatten (1a, b) zu erzeugen. Für den zweiten Schritt, verwenden wir einen akustischen Spender zur weiteren Stammverdünnungen von der Quelle Platten A verdünnen und B eine 11-Punkt - Konzentrationsbere.......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt die erfolgreiche Anwendung von automatisierten akustischen Ausgabe zu seriell Peptidproben über einen Konzentrationsbereich von 3 x 10 6 , die weniger als 1 ul Probe verdünnen. Der große Vorteil dieser Methode ist, über reduzierte Exposition von Proben zu experimentellen Behälter und Kunststoffgeschirr (wie Pipettenspitzen) Datenqualität durch Minimierung Peptid Adsorption an Kunststoffprodukte zu erhöhen, die für Reagenztransfer und Mischen normalerweise erforderlich sind. Während.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthin | Sigma-Aldrich | I7018 | Hergestellt als 0,5 M Stamm in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amid | Bachem | H-6795 | Hergestellt als 1 mg/ml Vorrat in PBS, bezeichnet als "100x Referenzkontrolle" |
| Testpeptide | Inhouse hergestellt bei MedImmune | Geliefert in verschiedenen Konzentrationen in DMSO oder PBS je nach Bedarf | |
| 100x Peptidbestand | Inhouse bei MedImmune | hergestellt Testpeptid verdünnt in Assay-Puffer auf die 100x erforderliche Endkonzentration | |
| Trypanblau-Lösung, 0,4 % | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Zellanalysator | Innovatis | ||
| Corning 384-Well-Platten, geringes Volumen | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo-qualifizierte 384-Well-Polypropylen-Mikroplatte | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo-qualifiziertes Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Tröpfchentransfervolumen in Schritten von 2,5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Tröpfchentransfervolumen in Schritten von 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Laborautomatisierung Planungssoftware für Life Science Robotik | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagenzienspender | ThermFisher Scientific | 5840300 | Bezeichnet als "Bulk Reagent Dispenser" |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
Referenzen
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, phys....
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Nachdrucke und Genehmigungen
