Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik
Summary
Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.
Abstract
küçük moleküllü ilaç keşfi olduğu gibi, peptid agonistleri için eleme konsantrasyon-tepki eğrileri elde etmek peptidlerin seri seyreltme gerektirir. peptidler Tarama geleneksel uç tabanlı numune alma yöntemleri adsorpsiyon yoluyla peptid kaybı için artan bir fırsat sağlayarak, plasticware geniş bir yüzey alanına peptidler maruz olarak karmaşıklık ek bir katman tanıyor. Plasticware aşırı maruz kalma önlenmesi plastik bağlılık yoluyla peptid kaybını azaltır ve böylece gücü tahmininde yanlışlıklar en aza indirir, ve biz daha önce peptid agonistleri 1 in vitro yüksek verimli tarama için dağıtım temassız akustik faydalarını tarif var. Burada fare glukagon benzeri peptit-1 reseptörü (GLP-1 R) peptit agonistlerinin taranmasında örnek kullanılarak mikrotiter plakalarında peptid seri dilüsyonları temassız akustik hazırlanması için bir tam entegre bir otomasyon çözümü tartışılmıştır. Bizim yöntemler yüksek izin-throughput agonistlerinin taranmasında da tahlilleri hücre bazlı ve kolay bir şekilde yüksek bir numune test etme desteklemek için, ya da (daha fazla hedef hücre çizgilerinin bir panel için, örneğin) deney plakası kopya sayısında artış sağlamak için büyütülebilir.
Introduction
GLP-1 R tip 2 diyabet 2 tedavisinde kurulu bir ilacın bir hedeftir. Bu reseptör için yerli peptit agonisti, GLP-1, 2-3 dakika 3 bir in vivo yarı-ömrü vardır. adenilil siklaz aktivasyonuna doğal G protein bağlanması yoluyla ikinci haberci cAMP'nin alt üretimindeki G protein bağlı hedef reseptör sonuçlarına GLP-1 bağlanması. biriken cAMP ölçümü sağlam bir tahlil reseptör aktivasyonunun izlemek ve tercih edilen bir fiziko-kimyasal özellikleri, aktif GLP-1 analogları taranması için içerir. Böyle bir deney, konsantrasyon-tepki eğrilerini oluşturmak için test numunelerinin seri seyreltme gerektirir ve peptid örnekleri teslim Bu, özellikle karmaşıktır. Ucu tabanlı seri seyreltme hazırlanmasından potansiyel hatalar, daha önce 1,4,5 tarif edilmiştir. Peptidler güvenilmez potens tahminlerinde sonuçlanan plasticware yapışır. Peptit kaybı t yoluyla minimize edilebilirO sığır serum tamponlarda albümini (BSA) ve silikonlu plasticware kullanımı, ama bağlayıcı proteinin eklenmesi düzensiz kalmaktadır. Özel olarak, deney kaplarına GLP-1 bağlanması değişim 6 tarif edilmiştir. Sulu tahlil tampon içine ipuçları ve mikrotiter plakaları liç ve protein fonksiyonu 7, 8 engelleyebilir laboratuvar plasticware kullanılan bu istikrar ajanlar daha da komplikasyon var. Bu nedenle, yöntemler plasticware maruziyeti azaltmak için ölçümlerin doğruluğunu artırmak için gereklidir.
Akustik Sıvı dağıtıcıları bitişik tahlil plaka 9 içinde hassas nanolitre damlacıklarının ejeksiyon sonuçlanan bir sıvı numunesinin yüzeyi üzerine, yüksek frekanslı akustik sinyal odaklanır. Akustik ejeksiyon kullanımı hazırlanması ve büyük sentetik bileşik kütüphanelerinin taranması için ilaç endüstrisinde standart ve teknoloji de küçük Moleküller için valide edilmiştires 10. Bildiğimiz kadarıyla, rekombinant ve sentetik peptidlerin hazırlanması için akustik dağıtılmasını tanımlamak için birinci grup ve daha önce bilinen ucu tabanlı yöntem 1 ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş doğruluk bildirmiştir.
Bu makalede, bir tam otomatik plaka taşıma robotik sistem üzerine temassız akustik transferi ile peptid seri ve direkt dilüsyonları hazırlanması entegrasyonunu anlatmaktadır. Örneklerin akustik transfer kapsayan bir dizi yöntem, daha önce, 11 tarif edilmiştir. Bu, iki aşamalı bir yöntem, ara stok konsantrasyonları hazırlamak için ve seri olarak tam doz-tepki eğrisi oluşturacak şekilde peptit analoglarını seyreltmek için kullanmaktadır. hazırlanan peptidler, hedef hücreler, fare GLP-1R ifade ile inkübe edilir, ve peptid agonisti activ bir okuma olarak, bu hücreler içinde, cAMP birikiminin ölçülmesi için ticari olarak elde edilebilen homojen zaman çözümlü bir fluoresans (HTRF) deneyi kullanımıSığ. Deney sağlam ve yüksek verimli bir 384-gözlü formata müsait ve rutin olarak, her iki deney geliştirme tatbik edildi ve ilaç tarama 12 çıkıntı olan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, seri örnek 1 'den az ul gerektiren, 3 x 10 6 bir konsantrasyon aralığı üzerinde peptid örnekleri seyreltilmesi için otomatik bir akustik dağıtma başarılı bir uygulama açıklanmaktadır. Bu yöntemin en önemli avantajı, normal reaktif ve karıştırmak için gerekli olan deney kapları (örneğin, pipet uçları gibi) plasticware örneklerin düşük maruz kalma ile plasticware peptit adsorpsiyonu en aza indirmek suretiyle veri kalitesinin artırmaktır. akustik dağıtım tamam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100X peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
- Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917 (2008).
- Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
- Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
- Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
- Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
- Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
- Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
- Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
- Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).
