يصف هذا البروتوكول كيفية تطعيم C57BL / 6J الفئران بسلالة EGD من المستوحدة الليستيريا (اللستيريا L.) وقياس الإنترفيرون γ (IFN-γ) ردود القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، القاتلة الطبيعية الخلايا التائية (NKT)، والتكيف الخلايا اللمفية تي بعد الإصابة. يصف هذا البروتوكول أيضا كيفية إجراء دراسات البقاء على قيد الحياة في الفئران بعد الإصابة مع تعديل LD 50 جرعة من العوامل المسببة للأمراض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العدوى التجريبية مع
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
اللستيريا L. هي نوع من البكتيريا إيجابية الجرام التي هي سبب الأمراض التي تنقلها الأغذية في البشر. وكانت العدوى التجريبية من الفئران مع هذا الممرض بالمعلومات كبير على دور الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية والسيتوكينات محددة في الحصانة المضيف ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا. إنتاج الإنترفيرون γ الخلايا الفطرية خلال العدوى دون المميت مع المستوحدة L. مهم لتفعيل الضامة والمكافحة المبكرة من مسببات المرض 1-3. وبالإضافة إلى ذلك، إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا الليمفاوية الذاكرة التكيف مهم لفتيلة تنشيط الخلايا الفطرية على الإصابة مرة أخرى 4. وL. المستوحدة نموذج العدوى بالتالي بمثابة أداة عظيمة للتحقيق في ما إذا كانت العلاجات الجديدة التي تهدف إلى زيادة إنتاج الإنترفيرون γ لها تأثير على ردود الإنترفيرون جاما في الجسم الحي ولها آثار بيولوجية الإنتاجية مثل زيادة إزالة البكتيريا أو تحسين البقاء على قيد الحياة الماوس من عندعدوى. وصفت هنا هو بروتوكول الأساسي لكيفية إجراء التهابات في الغشاء البريتوني من C57BL / 6J الفئران بسلالة EGD من المستوحدة L. ولقياس إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا NKT، والخلايا الليمفاوية التكيف التدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، وصفت الإجراءات ما يلي: (1) النمو وتعد البكتيريا للتلقيح، (2) قياس الحمولة الجرثومية في الطحال والكبد، و (3) بقاء التدبير الحيوان إلى النهاية. يتم توفير بيانات تمثيلية أيضا لتوضيح كيفية هذا النموذج العدوى يمكن استخدامها لاختبار تأثير عوامل معينة على الردود IFN-γ إلى المستوحدة L. وبقاء الفئران من هذه العدوى.
المقدمة
IFN-γ هو خلوى أن أمر حاسم للوساطة مناعة ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا والسيطرة على نمو الورم 5. أهمية هذا خلوى في مقاومة البكتيريا هو واضح في الملاحظة بأن البشر مع طفرات في إشارة مسار IFN-γ هي عرضة للإصابة مع المتفطرات وsalmonellae 6. وبالمثل، الفئران التي تعاني من نقص في أي من الإنترفيرون γ أو العيوب مستقبلات المعرض الإنترفيرون جاما في مقاومة المتفطرات 7-9 وغيرها من مسببات الأمراض داخل الخلايا بما في ذلك L. المستوحدة 10،11، الليشمانيا الرئيسي 12، السالمونيلا التيفية الفأرية 13، وبعض الفيروسات 11. بالإضافة إلى مسببات الأمراض....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بيان السلامة
يصف هذا البروتوكول إصابة الفئران مع المستوحدة L. الحية. تتم معالجة العوامل المسببة للأمراض بأمان في ظل ظروف BSL2 من قبل أفراد مدربين الذين لا يعانون من نقص المناعة. تشمل الأشخاص القليلي المناعة النساء الحوامل وكبار السن والأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية أو لديهم أمراض مزمنة تتطلب علاجا للمناعة. يجب على العاملين ارتداء معطف واقية المختبر أو ثوب، والقفازات، وقناع، وحماية العين أثناء التعامل مع العينات المصابة. تم تنفيذ العمل الموصوف في هذه الوثيقة تحت شروط BSL2 بموجب شهادة (# 32876) الذي صدر عن شبكة الصحة جامعة (UHN) السلامة الأحيا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويعرض الشكل 3 بعض تدفق نموذجي الخلوي تلطيخ IFN-γ في الخلايا القاتلة الطبيعية وNKT الطحال في 24 ساعة بعد العدوى مع 10 5 كفو من مسببات المرض. كما يوضح هذا الرقم استراتيجية النابضة لوحة تلطيخ هو موضح في الجدول رقم (2). ويبين الشكل 4 بعض البيانات التمثيلية التي تم الحصول عليها في تجربة واحدة حيث تم علاج ذكور الفئران مع IS001 أو مراقبة المركبات PPARα خصم، مصابا 10 5 اللستيريا
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية إجراء العدوى التجريبية الأساسية مع سلالة EGD من L. اللستيريا 25 في الذكور أو الإناث C57BL / 6J الفئران. تم تعيين هذا البروتوكول لهذا الغرض من دراسة تأثير رواية IS001 جزيء صغير على إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا الليمفاوية الفطرية والتكيفية في الجسم الحي 31. من خلال رصد إزالة البكتيريا والبقاء على قيد الحياة بعد الإصابة، وقد اكتسبت نظرة ثاقبة كيف أثرت هذه التغييرات في الإنترفيرون γ قدرة المضيف للسيطرة على العدو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
تم دعم تطوير هذا البروتوكول بمنحة تشغيلية من CIHR (MOP97807) إلى SED.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مرق ضخ قلب الدماغ ، معدل | د.ب | 299070 | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة |
| Agar | BD | 214010 | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة |
| 1x PBS | Sigma | D8537 | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة |
| كلوريد الأمونيوم (NH3< / sub>Cl) | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| KHCO3< / sub>يجب | أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| Na2< / sub>EDTA | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة |
| مصل الأبقار الجنينية | Gibco | 12483 | قبل الاستخدام ، قم بتعطيل الحرارة عند 56 درجة ؛ C لمدة 30 دقيقة |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية | Gibco | 11140 | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة |
| البنسلين / الستربتومايسين | Gibco | 15140 | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة |
| مثبط نقل البروتين GolgiStop (يحتوي على Monensin) BD | 554724 | الاستخدام 4 & mu ؛ ل في 6 مل ثقافة خلية | |
| 16٪ Paraformaldehye | علوم المجهر الإلكتروني | 15710 | تمييع إلى 4٪ PFA في ddH 2< / sub>O أو 1x PBS |
| 10x Perm / Wash buffer | BD | 554723 | تخفيف 1x في ddH 2< / sub> |
| O كتلة Fc ، مضاد للفأر CD16 / CD32 منقى | eBioscience | 14-0161 | تمييع 1:50 |
| صبغة قابلة للإصلاح eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | تمييع 1: 1,000 (استخدمنا أيضا أصباغ الجدوى من المجسات الجزيئية) مضاد |
| للفأر CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | توصي الشركة المصنعة بحجم اختبار معين ؛ ولكن يجب معايرة هذا قبل الاستخدام. |
| مضاد للفأر CD8-FITC (53-6.7) | توصي الشركة المصنعة بحجم اختبار معين ؛ ولكن يجب معايرة هذا قبل الاستخدام. | ||
| PBS57 / mCD1d رباعي - APC | NIH Tetramer Core Facility | N / A | تم الحصول عليها كهدية من المنشأة |
| المضادة للفأر TCR & beta ؛ -PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | توصي الشركة المصنعة بحجم اختبار معين ؛ ومع ذلك يجب معايرة هذا قبل الاستخدام. |
| مضاد للفأر NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | توصي الشركة المصنعة بحجم اختبار معين ؛ ولكن يجب معايرة هذا قبل الاستخدام. |
| مضاد للفأر CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | توصي الشركة المصنعة بحجم اختبار معين ؛ ولكن يجب معايرته قبل الاستخدام. |
| ل IFN gamma-PE (XMG1.2 | eBioscience | 12-7311 | بحجم اختبار معين ؛ ولكن يجب معايرة هذا قبل الاستخدام. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | استخدم قطرة واحدة لكل بقعة |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | تستخدم لقياس الإنترفيرون جاما في أنبوب طافي 50 |
| مل للثقافة | تستخدم لزراعة البكتيريا ، يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| 1.5 مل أنابيب | أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| يجب أن تكون أطباق | البكتيرية أي علامة تجارية مناسبة | ||
| 2 مل cyrovials | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| مطياف | ، يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| ، يجب | أي علامة تجارية مناسبة ، يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| C57BL / 6J | Jackson laboratories | Stock # 000664 | طلب ل الوصول في 7 أسابيع |
| التبييض | لإزالة التلوث | ||
| 70٪ الإيثانول | لإزالة التلوث | ||
| أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | |||
| الطرد | الدوار والدلاء وأغطية الجرافة. | ||
| يجب أن تكون أجهزة الطرد المركزي | الدقيقة ، أي علامة تجارية | ||
| ، يجب | تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| ، نصائح | الماصة ، يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| ، | أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| ، الأدوات | ، يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| ، 70 ميكرون المصافي يجب | أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| حقنة 3 مل ، | يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| ، يجب | أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| وحدات | أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 إلى 9 in ddH2< / sub>O ، يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| يجب أن يكون مقياس | أي علامة تجارية مناسبة | ||
| لوحات مستديرة القاع يجب | أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| أنابيب FACs | فيشر Scientific | 14-959-5 | |
| BD LSR II | BD | يمكن استخدام أي مقياس خلوي للتدفق للحصول على تكوين ليزر مناسب ومجموعة مرشح للتمييز بين الفلوروكورميس | |
| Flowjo برنامج | Treestar | يستخدم لتحليل البيانات. ستكون الأنواع الأخرى من برامج تحليل البيانات مناسبة | |
| ماصة متعددة القنوات (0 - 300 وميكرو ؛ ل) | Eppendorf | يستخدم لغسل الخلايا وإضافة الأجسام المضادة أثناء تلطيخ قياس التدفق الخلوي تلطيخ | |
| حمض | المستخدم لغسل الخرز الزجاجي ، يجب أن تكون أي علامة تجارية مناسبة | ||
| لنظام الحفاظ على البكتيريا Microbank | التشخيص | المختبر يستخدم كبديل لمخزون الجلسرين لتخزين البكتيريا على المدى الطويل |
المراجع
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
